CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỂ ĐÁNH GIÁ DƯỢC LIỆU

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỂ ĐÁNH GIÁ DƯỢC LIỆU

Đánh giá một dược liệu nghĩa là xác định dược liệu đó có đúng tiêu chuẩn quy định hay không. Khi đánh giá thì dựa vào tiêu chuẩn nhà nước được ghi trong Dược điển hoặc tiêu chuẩn ngành. Tiêu chuẩn của một dược liệu quy định: Đặc chất, độ tro, độ ẩm. Những tiêu chuẩn đó được đề ra để đảm bảo chất lượng của thuốc và có căn cứ để giao dịch trên thị trường. Có thể sắp xếp các phương pháp đánh giá như sau:

1. Cảm quan:

Phương pháp cảm quan nghĩa là dùng các giác quan của chúng ta để đánh giá như nhìn bên ngoài về hình dáng, kích thước, màu sắc; đối với một vài dược liệu thì cần phải bẻ ra để quan sát bên trong. Mùi là đặc điểm của nhiều  dược liệu chứa tinh dầu, nhựa. Vị có thể ngọt như cam thảo, cỏ ngọt; chua đối với dược liệu chứa acid hữu cơ; đắng như đối với các dược liệu chứa alkaloid, glycosid; cay như ớt, gừng…

2. Sử dụng kính hiển vi:

Phương pháp đánh giá dựa vào kính hiển vi bao gồm soi vi phẩu và soi bột. Đây là phương pháp hay dùng nhất để kiểm nghiệm dược liệu. Trong một vài trường hợp phương pháp này lại có ưu thế hơn phương pháp hóa học Ví dụ để phân biệt các loại tinh bột người ta không thể dựa vào phương pháp hóa học mà phải nhờ vào kính hiển vi. Một vài mảnh lá trúc đào trong dạ dày tử thi được xác định dễ dàng bằng soi vi phẫu hơn là làm phản ứng tìm oleandrosid. Dùng kính hiển vi không chỉ để xác định sự giả mạo mà còn có thể ước lượng tỷ lệ chất giả mạo căn cứ vào số lượng một đặc điểm nào đó của mẫu kiểm nghiệm so sánh với mẫu đối chứng.

3. Phương pháp hóa học:

Phần lớn các dược liệu đều có thành phần hoạt chất xác định. Các hoạt chất này có thể cho các phản ứng màu đặc trưng, người ta dựa vào đó để định tính và định lượng. Ví dụ các anthranoid thì dựa vào phản ứng Borntraeger, các glycoside tim thì dựa vào các phản ứng của các dẫn chất nitro thơm. Đối với alkaloid thì dựa vào tính kiềm định lượng bằng phương pháp acid - kiềm. Đôi khi người ta lại dựa vào thành phần hóa học không phải là hoạt chất nhưng lại đặc trưng cho dược liệu đó để đánh giá. Chúng ta sẽ tìm hiểu cụ thể trong các chương về sau.

4. Phương pháp vật lý:

Trong nhiều trường hợp có thể phát hiện bị pha lẫn hay giả mạo bằng cách soi mặt cắt dược liệu hay bột dược liệu dưới ánh đèn phân tích tử ngoại. Có khi trước khi soi người ta nhỏ thêm trên bột dược liệu một vài loại thuốc thử (kiềm, acid…). Một số cao dược liệu cũng cho màu sắc khác nhau, các hoạt chất cũng vậy, ví dụ aconitin (lơ sáng), berberin (vàng), emetin (đỏ cam). Quinin cho màu xanh lơ trong dung dịch oxy acid ngay dưới ánh sáng thường và rất rõ dưới ánh đèn tử ngoại.

Việc ứng dụng các hằng số vật lý để đánh giá thường hay tiến hành đối với tinh dầu, dầu béo và các hoạt chất:

Độ hòa tan: (thường biểu thị như sau: 1g tan trong …ml nước, …ml cồn ethylic, glycerin…)

Tỷ trọng: (đặc biệt đối với tinh dầu và dầu béo), ví dụ: tỷ trọng tinh dầu bạc hà ở 20⁰C: 0,890-0,922. Tỷ trọng mật ong ở 20⁰C không dưới 1,38.

Góc quay cực riêng:

       Đối với  chất lỏng như tinh dầu, dầu béo thì [α]_D²⁵=α/l.d

       Đối với hoạt chất rắn thì [α]_D²⁵= α.100/l.c

       α: Góc quay cực đo được.

       l: bề dày lớp chất tính bằng decimet.

       d: tỷ trọng chất.

       c: nồng độ phần trăm của chất trong dung dịch.

       Đo góc quay cực và tỉ trọng ở cùng một nhiệt độ, ví dụ ở đây là 25⁰C.

Chỉ số khúc xạ: (Đặc biệt đối với tinh dầu và dầu béo) Ví dụ: chỉ số khúc xạ của tinh dầu hương nhu trắng ở 20⁰C: 1,510 – 1,528.

Nhiệt độ đông đặc: (Đối với tinh dầu và dầu béo) ví dụ: nhiệt độ đông đặc của tinh dầu hồi phải trên +15⁰C.

Nhiệt độ nóng chảy: (Đối với sáp ong hoặc các hoạt chất alcaloid, glycosid…) ví dụ nhiệt độ nóng chảy của sáp ong vàng: 62-66⁰C.

5. Xác định độ ẩm:

Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định ví dụ Dược điển II tập 3 quy định độ ẩm của lá thanh cao hoa vàng: không quá 13%, quá độ ẩm đó thì dược liệu dễ bị mốc, hư hỏng. Song song với việc định lượng hoạt chất thì cũng cần phải xác định độ ẩm để qui hàm lượng so với dược liệu khô tuyệt đối.

Có thể xác định độ ẩm bằng những cách sau đây:

- Sấy trong tủ sấy ở áp suất bình thường.

- Sấy trong tủ sấy ở áp suất giảm (có máy hút chân không).

- Làm khô trong bình hút ẩm với những chất hút nước mạnh như acid sulfuric đậm đặc, phosphorpentoxid và ở áp suất giảm (có máy hút chân không).

Hai cách sau thường được áp dụng với những dược liệu quý dễ bị hỏng bởi nhiệt độ và ta cần thu hồi ví dụ sữa ong chúa, nọc rắn…

Đối với dược liệu chứa tinh dầu thì xác định độ ẩm bằng phương pháp cất lôi cuốn đẳng phí, nghĩa là lôi cuốn nước bằng cách cất với một dung môi hữu cơ không trộn lẫn được với nước nhưng lại cho với nước một hỗn hợp đẳng phí có nhiệt độ sôi ổn định. Sauk hi ngưng tụ và để nguội, nước được tách ra và đọc thể tích. Dung môi có thể dùng là xylem, toluene.

6. Định lượng tro

Tro toàn phần: Tro toàn phần là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu. Để có thể so sánh được kết quả, cần phải tiến hành trong những điều kiện nhất định. Ví dụ, trong chén nung bằng sứ, đường kinh 35mm, sơ bộ đã đem nung đỏ, để nguội và cân bì, đặt mẫu dược liệu đã cắt hoặc tán nhỏ (1-5gram) đã được cân chính xác. Lúc đầu đốt nhẹ rồi tăng dần nhiệt độ để dược liệu cháy hết. Cần theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ để tránh than không bị thoát ra khỏi miệng chén. Đốt xong cho chén vào lò nung ở nhiệt độ 500⁰C cho đến khi thu được khối lượng không đổi. Để tránh các dược liệu hóa gỗ tạo ra than khó đốt cháy, có thể ngừng nung rồi làm ẩm bằng  nước cất hoặc acid nitric đậm đặc rồi đem nung lại. Sauk hi tro không còn màu đen, người ta để nguội trong bình hút ẩm và đem cân.

Tro không tan trong acid hydrochloric: Thêm vào tro toàn phần 5ml HCl 10%. Đậy chén nung bằng một mặt kính đồng hồ và đun cách thủy trong 10 phút. Dùng 5ml nước cất nóng để rửa mặt kính đồng hồ và dùng nước rửa này để pha loãng dung dịch còn lại trong chén. Lọc dung dịch qua giấy lọc không tro, rửa cắn và giấy lọc bằng nước cất nóng cho đến khi nước rửa không còn phản ứng của ion chlorid nữa. Chuyển giấy lọc có cắn vào chén nung ở trên, sấy khô, đốt rồi nung ở nhiệt độ 500⁰C cho đến khối lượng không đổi. Trừ trường hợp đặc biệt như mộc tặc, tro biểu thị chủ yếu là cát cấu tạo bởi silic oxyd do dược liệu không làm sạch kỹ.

Tro sulfat: Tro sulfat là tro còn lại sau khi nhỏ aicd sulfuric lên dược liệu và đem nung. Phương pháp này cho kết quả ổn định hơn phương pháp tro toàn phần vì các carbonat và oxyd được chuyển thành sulfat.

7. Phương pháp sắc ký:

Đây là phương pháp rất hữu hiệu áp dụng để định tính, định lượng và chiết tách các thành phần hóa học của dược liệu. Về cơ sở lý thuyết sắc ký, sinh viên đã được học ở môn phân tích. Ở đây chỉ nhắc lại một số loại sắc ký hay áp dụng cho dược liệu: sắc ký cột, sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí.

Sắc ký cột: Sắc ký cột bao gồm sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột hiện đại hay còn gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp.

Trong sắc ký cột cổ điển người ta thường dùng các cột thủy tinh đường kính 1-5cm dài 30-100cm. Hạt nhồi cột đường kính từ 150-300μm. Sauk hi các chất được tách trên pha tĩnh ta có thể lấy từng phần của pha tĩnh có mang chất đem ra chiết lấy từng chất. Nếu các dược chất được tách ra ngoài pha tĩnh thì ta hứng lấy các phân đoạn dịch rửa có hòa tan các chất nhờ một bộ phận góp tự động.

Trang bị cho sắc ký cột cổ điển rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các thành phần hóa học của dược liệu.

Trong sắc ký lỏng cao áp, chất nhồi cột có cỡ hạt 3-10μm. Vì hạt rất nhỏ, dung môi chảy khó nên phải dùng bơm để nén. Sắc ký lỏng cao áp có khả năng tách các chất rất tốt.

Dung môi (pha di động) để rửa phải rất tinh khiết. Cần lọc loại vẩn và đuổi hết khí hòa tan bằng siêu âm hoặc đun nóng, khuấy hút hoặc sục khí trơ. Bơm nén phải tạo được áp suất cao 200-500atm. Cột bằng thép không rỉ có đường kính trong 4-10mm, dài 10-30cm. Có loại nhỏ chiều dài 3-10cm, đường kính 1-4mm. Cột thủy tinh chỉ dùng ở áp suất dưới 50atm. Khi dung môi hòa tan chất ra khỏi cột thì đi qua detectơ rồi được ghi trên bộ phận ghi tự động. Có nhiều loại detectơ nhưng loại detectơ hay được dùng là detectơ quang phổ tử ngoại và khả biến.

Tùy theo bản chất hiện tượng sắc ký người ta chia ra sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel.

Trong sắc ký hấp phụ, nhôm oxyd, silicagel hay được sử dụng. Trong qua trình khai triển hoặc rửa giải thì các chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh. Về pha động ta có thể sử dụng các dung môi với độ phân cực tăng dần:

Dung môi	εo
Ether dầu	0,01
Hexan	0,01
Heptan	0,01
Cyclo	0,04
Carbon tetrachlorid	0,18
Ether isopropylic	0,28
Toluen	0,29
Benzen	0,32
Ether ethylic	0,38
Chloroform	0,40
Methylen chlorid	0,42
Dichlor ethan	0,49
Aceton	0,56
Dioxan	0,56
Butanol	0,56
Ethyl acetat	0,58
Acetonitril	0,65
Pyridin	0,71
Dimethylsulfoxid	0,75
Alcol isopropylic	0,82
Alcol ethylic	0,88
Alcol methylic	0,95

Muốn có dung môi với trị giá trung gian không có trong bảng trên, ta dùng hỗn hợp pha với hai dung môi theo tỉ lệ thích hợp.

Trong sắc ký phân bố, pha tĩnh được chia làm 2 loại: Loại thứ nhất, chất lỏng được mang trên bề mặt của hạt chất mang, qua quá trình rửa giải dần dần bị dung môi hòa tan, hiện nay ít được dùng. Loại thứ hai, pha tĩnh được kết hợp với chất mang. Ví dụ chất mang có thể là silicagel đã tạo thành những dẫn chất siloxan

  Siloxan

Nếu R là nhóm kém phân cực như octyl (C8) octadecyl (C18) và pha động là dung môi phân cực như methanol, acetonitril thì gọi là sắc ký pha đảo. Hiện nay sắc ký pha đảo hay được dùng vì tách tốt áp dụng cho nhiều nhóm hợp chất hóa học. Ngược lại nếu R là nhóm phân cực thì ta có sắc ký pha thuận.

Trong sắc ký qua gel, pha tĩnh là dung môi nằm trong các lỗ xốp của hạt gel, pha động là dung môi chảy giữa các hạt. Các chất phân tích có phân tử lượng lớn sẽ di chuyển theo dung môi và đi ra khỏi cột trước. Các phân tử nhỏ thì khuếch tán vào lỗ xốp và sẽ đi ra chậm.

Sắc ký giấy: Sắc ký giấy chủ yếu thuộc sắc ký phân bố. Pha tĩnh được thấm trên một tờ giấy thấm đặc biệt gọi là giấy sắc ký. Có nhiều loại giấy có số khác nhau tùy theo độ thấm và nhiều hãng sản xuất khác nhau. Khi tiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp. Có 2 phương pháp: sắc ký đi lên và sắc ký đi xuống tùy thuộc vào chiều đi của pha động. Tỷ lệ giữa khoảng cách đường đi của chất phân tích với đường đi của pha động tính từ điểm đặt chất phân tích gọi là R_f. Tỷ lệ giữa khoảng cách đường đi của chất phân tích với đường đi của một chất đối chiếu được gọi là R_r. Các trị số R_f của nhiều hoạt chất quen thuộc trong dược liệu thường được ghi trong các bảng trong các sách để tra cứu đối chiếu. Các vết của chất được phân bố trên giấy sắc ký gọi là sắc phổ. Sắc phổ được phát hiện bằng màu sắc, kích thước, hình dạng các vết hiện ra khi quan sát ở ánh sáng thường hoặc ánh sáng đèn phân tích tử ngoại trước và sau khi phun các chất thử. Người ta dựa vào R_f hoặc R_rhoặc vào các sắc phổ để xác định đối chiếu các thành phần hóa học của một dược liệu. Để có kết luận chắc chắn thường phải tiến hành trên 3 hệ dung môi. Trong nhiều trường hợp cần phải tiến hành sắc ký hai chiều trên một tờ giấy vuông mới hi vọng tách được các vết (các thành phần) trên một sắc phổ. Muốn vậy, đặt dung dịch cần phân tích ở góc một tờ giấy. Sau khi triển khai lần một thì chuyển tờ giấy đó sang một buồng sắc ký thứ hai, quay giấy một góc 90⁰ và nhúng vào dung môi thứ hai để triển khai lần hai. Sau khi hiện màu, các vết phân bố trên mặt phẳng chứ không phải trên một đường thẳng.

Sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng chủ yếu là sắc ký hấp phụ tuy nhiên cũng có thể là sắc ký phân bố hoặc kết hợp cả hai tùy thuộc vào bột để tạo lớp mỏng và dung môi sử dụng. Người ta trải một lớp mỏng có chiều dày 0,2-0,3mm thật đều bằng tay hay bằng dụng cụ các bột mịn silicagel hoặc nhôm oxyd, kieselguhr… trên một tấm kính. Bột có thể không thêm chất dính (tráng khô) hoặc có thể thêm chất dính ví dụ silicagel có trộn thêm CaSO₄ (tráng ướt). Hiện nay có nhiều hãng sản xuất các bản sắc ký tráng sẵn trên tấm nhôm hoặc trên tấm nhựa. thời gian triển khai  đối với sắc ký lớp mỏng nhanh hơn sắc ký giấy, lượng chất phân tích cần ít hơn, ngoài ra có thể sử dụng các thuốc thử như acid sulfuric, nitric đạm đặc… Cũng như sắc ký giấy, ở đây sắc ký hai chiều cũng được ứng dụng.

Đối với sắc ký giấy cũng như sắc ký lớp mỏng, diện tích của một vết tách ra sau khi khai triển với một loại dung môi thì tỷ lệ với lượng chất có trong vết đó nên có thể làm cơ sở định lượng. Người ta có thể cắt (nếu là SKG) hoặc cạo bột (nếu là SKLM) từng vết rồi hòa tan hoạt chất chứa trong đó bằng một dung môi thích hợp, sau đó định lượng bằng các phương pháp thích hợp như đo huỳnh quang, đo màu, đo phổ tử ngoại.

Sắc ký khí: Đây là loại sắc ký phân bố. Ở đây tướng tĩnh là chất lỏng được bao trên những hạt rất nhỏ gọi là chất mang: kiegelguhr, gạch chịu lửa hoặc diatomit.

Chromo-sorb W là chất mang được điều chế bằng cách nung diatomid với lượng nhỏ natri carbonat và sau đó đem nghiền nhỏ theo độ mịn thích hợp, bột có màu trắng. Chromosorb P thì màu hồng và được điều chế bằng cách đốt nóng chứ không nung. Sự chọn lựa pha tĩnh tùy thuộc vào nhiệt độ tiến hành trên cột và tùy thuộc vào chất phân tích. Pha tĩnh không bay hơi ở nhiệt độ khai triển và không được có phản ứng với chất mang cũng như chất phân tích. Sau đây là một số chất dùng làm pha tĩnh cùng với nhiệt độ: không phân cực như dầu silicon 200-250⁰, dầu apiezon 275-300⁰, squalen 75⁰; hơi phân cực như các alcol có độ sôi cao và những ester của chúng 100-225⁰; rất phân cực như các chất polypropylene glycol và những ester của chúng 225⁰. Tỉ lệ pha tĩnh cũng có thể được dùng đến 25% trên cột. Người ta có thể phân tán pha tĩnh trên chất mang trơ bằng cách hòa tan nó trong một dung môi có điểm sôi thấp ví dụ ether, trộn cẩn thận với chất mang, trải ra để bốc hơi ether. Người ta còn dùng loại kết hợp vừa chất mang vừa pha tĩnh ví dụ bột “Porapak” (tên thương mại) là chất polymer tạo thành do trùng hợp giữa ethylvinyl benzene với divinyl benzene có những mạch nối chéo tạo thành lỗ xốp.

Pha động là một khí trơ. Việc chọn khí phụ thuộc vào detector. Các khí thường dùng là hydrogen, nitrogen, helium và argon. Tốc độ khí rất quan trọng, nếu quá cao thì sự tách các chất không hoàn hảo, quá chậm thì thời gian lưu giữ quá lâu và có hiện tượng khuếch tán pic. Đối với cột loại ngắn thì tốc độ dòng khí là 10-50ml/phút. Mẫu phân tích được đưa vào đầu cột bằng một loại bơm tiêm đặc biệt thường là 0,05-0,1ml. Đối với một vài loại detector thì lượng còn ít hơn. Hỗn hợp phân tích phải bốc hơi ngay khi bắt đầu tiếp xúc với tướng lĩnh. Đối với các thành phần có điểm sôi thấp thì có thể triển khai ở nhiệt độ thường. Một số khác đòi hỏi nhiệt độ cao hơn ví dụ tinh dầu thường ở 150-300⁰, các thuốc trừ sâu có thể đến 400⁰. Hiện nay các máy sắc ký đều hoạt động theo chương trình nhiệt nghĩa là nhiệt độ cột tăng dần trong quá trình khai triển. Có một số chất tuy bản thân nó không bôc hơi được nhưng có thể chuyển thành dẫn chất bốc hơi được thì cũng có thể phân tích bằng sắc ký khí, ví dụ các chất có nhóm OH như các đường, flavonoid, morphin, codein, cardenoid… thì chuyển thành các dẫn chất trimethylsiloxy:

2ROH  + (CH₃)₃SiNHSi(CH₃) → 2 ROSi(CH₃)₃ + NH₃

Trong sắc ký người ta hay dùng detector dựa vào phương pháp độ dẫn điện hoặc phương pháp ion hóa ngọn lửa.