PHÂN LẬP CÁC HOẠT CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU

II.       PHÂN LẬP CÁC HOẠT CHẤT

 

Phân lập là tách riêng một chất dưới dạng tinh khiết ra khỏi một hỗn hợp. Thành phần của một dược liệu thường rất phức tạp, trong nhiều trường hợp, chỉ một hoặc vài chất trong hỗn hợp toàn phần của dược liệu được sử dụng làm thuốc, ví dụ, strychnin trong hạt Mã tiền, vincristin và vinblastin trong Dừa cạn, paclitaxen trong Taxus, quinin và quinidin từ Canh kina... Để tách riêng hoạt chất hoặc trong nghiên cứu muốn tách riêng các chất để xác định cấu trúc, làm chất chuẩn, nghiên cứu dược lý... người ta cần tiến hành phân lập từng chất dưới dạng tinh khiết.

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phân lập các chất từ một hỗn hợp. Có các phương pháp kinh điển như các phương pháp kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn hay các kỹ thuật sắc ký hiện đại v.v...

1.  Kết tinh phân đoạn

Phương pháp dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất khi hòa tan hỗn hợp vào một hoặc một hỗn hợp dung môi. Trong quá trình để yên để dung môi bốc hơi từ từ, thành phần khó tan nhất sẽ tủa hoặc kết tinh trước. Lọc lấy phần tinh thể thô và kết tinh lại sẽ thu được chất tinh khiết. Phần dung dịch còn lại có thể để bay hơi dung môi và kết tinh để tách các chất khác. Có thể kết hợp việc bay hơi dung môi với giảm nhiệt độ để quá trình kết tinh hiệu quả hơn. Dung môi dùng để hòa  tan/kết tinh phân đoạn thường là một dung môi nhưng cũng có thể là một hỗn hợp 2 hay 3 dung môi trong trường hợp các chất khó kết tinh. Đối với một số nhóm chất đặc biệt, để phân lập người ta tạo ra các dẫn chất ít tan ví dụ tạo muối picrat alcaloid, tạp osazon các đường để các chất dễ kết tinh hơn.

2.  Tách phân đoạn

Đối với một vài nhóm chất, người ta có thể tách riêng từng phân đoạn khỏi hỗn hợp dựa vào lý hóa tính khác nhau của các chất thành phần như độ hòa tan trong các dung môi, tính acid hay base và độ mạnh của tính acid hay base. Ví dụ, một hỗn hợp muối alcaloid trong nước, khi kiềm hóa từ từ thì alcaloid có tính kiềm yếu nhất sẽ được giải phóng ra dạng tự do trước, nếu kiềm hóa tiếp thì lần lượt các alcaloid có tính kiềm mạnh hơn sẽ được tiếp tục giải phóng. Nếu ta dùng dung môi hữu cơ để chiết sau từng giai đoạn thì sẽ thu được các alcaloid khác nhau. Cũng như vậy đối với một hỗn hợp acid hữu cơ dưới dạng muối sẽ được giải phóng từng phân đoạn khi thêm từ từ acid vô cơ rồi chiết bằng dung môi hữu cơ.

3.  Thăng hoa

Một số chất hay nhóm hợp chất có thể thăng hoa được như các coumarin và anthranoid ở dạng tự do (aglycon); cafein, ephedrin, camphor, borneol... có thể được tách ra khỏi hỗn hợp hay được tinh chế bằng cách cho thăng hoa. Quá trình thăng hoa có thể được thực hiện ở áp suất thường hay áp suất giảm. Khi thăng hoa dưới áp suất giảm, nhiệt độ thăng hoa của các chất giảm làm giảm bớt tác động phân hủy của nhiệt độ lên các chất. Với các dụng thăng hoa dưới áp suất giảm có thể theo dõi áp suất và nhiệt độ người ta có thể thăng hoa cả những chất khó hay không thực hiện được bằng cách thăng hoa ở áp suất thường. Với dụng cụ này người ta có thể phân lập, tinh chế một số alcaloid, flavonoid...

4.  Chưng cất phân đoạn

Chưng cất phân đoạn là một trong những phương pháp kinh điển dùng để tách các chất bay hơi ra khỏi một hỗn hợp dựa vào sự khác biệt nhiệt độ sôi của các chất trong hỗn hợp. Quá trình chưng cất có thể thực hiện ở áp suất khí quyển hay áp suất giảm. Phương pháp chưng cất phân đoạn được thực hiện với những bình cất có lắp cột phân đoạn và thường được nối với máy hút chân không để giảm nhiệt độ chưng cất, giảm ảnh hưởng tới các chất nhạy cảm với nhiệt độ. Nhiệt độ và áp suất được theo dõi trong quá trình chưng cất. Phương pháp này thường áp dụng để tách các chất thành phần của tinh dầu.

5.         Các phương pháp sắc ký

Sắc ký điều chế là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các chất tự nhiên. Thành phần của các dịch chiết thực vật thường rất phức tạp, thường vài chục chất. Tính chất của các chất cần tách cũng rất thay đổi, từ các chất không hay rất kém phân cực tới các chất phân cực mạnh, từ các chất phân tử nhỏ tới các đại phân tử. Hàm lượng các chất trong hỗn hợp cũng rất thay đổi, từ vài % tới phần nghìn hay thậm chí hơn trong một số trường hợp. Trong các trường hợp như vậy, các phương pháp phân lập cổ điển như kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn v.v... không thể đáp ứng được. Khi đó, các kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng áp suất trung bình, sắc ký lỏng cao áp điều chế và sắc ký ngược dòng sẽ là các kỹ thuật được lựa chọn sử dụng. Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng cao áp điều chế, về mặt lý thuyết và thiết bị đã được đề cập tới ở phần các phuơng pháp đánh giá dược liệu. Dưới đây là một số kỹ thuật sắc ký khác, đặc trưng cho phân lập các chất thường sử dụng trong nghiên cứu dược liệu.

5.1.   Sắc ký cột

Sắc ký côt là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột hình trụ hở 2 đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đường kính trong rất hẹp. Theo nghĩa rộng, sắc ký cột bao gồm cả sắc ký cột cổ điển dùng trong điều chế các chất và sắc ký cột hiện đại thường dùng trong phân tích như HPLC, GC... ở đây chỉ trình bày các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển. Với kích thước cột lớn, sắc ký cột cổ điển chủ yếu được dùng trong việc chiết tách và phân lập các chất.

Trong sắc ký cột cổ điển, người ta thường dùng các cột thủy tinh đường kính 1 -  5cm dài 30 – 100cm để nhồi pha tĩnh. Chất nhồi cột có kích thước từ 15 - 300µm. Kích thước hạt càng lớn, dung môi qua cột càng dễ dàng nhưng hiệu năng tách kém. Với vật liệu nhồi cột là Silica gel dùng cho sắc ký cột, người ta thường phân ra làm 3 loại là loại mịn (15 - 40µm), loại vừa (40 - 63µm) và loại thô (63 - 200µm). Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp của mẫu và khả năng tách của hệ thống. Tỉ lệ mẫu / pha tĩnh thường là 1/30 – 1/100 hay hơn. Trong 1 vài kỹ thuật, tỉ lệ này có thể tăng tới 1/10.

Cột sẽ được triển khai bằng dung môi thích hợp. Dung môi có các chất được tách ra sẽ đi ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bằng bộ phận hứng phân đoạn. Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và những phân đoạn giống nhau được gộp chung, loại dung môi để thu được chất tinh khiết. Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, các băng chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các “khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất.

Trong sắc ký cột cổ điển, áp lực đẩy dòng dung môi qua cột là áp suất thủy tĩnh. Với cột dài và chất nhồi cột mịn, tốc độ dòng dung môi giảm có thể ảnh hưởng đến kết quả sắc ký do hiện tượng khuyếch tán. Thời gian khai triển cũng rất dài, có khi là nhiều ngày hay hơn. Để khắc phục phần nào nhược điểm này, một số kỹ thuật sắc ký cột cải tiến đã được sử dụng giúp giảm thời gian phân tách. Tuy nhiên, hiệu lực tách của cột cũng có thể giảm. Khi ấy người ta thường thu các phân đoạn đơn giản để tiếp tục phân tách trên các cột sắc ký khác. Hai kỹ thuật hay sử dụng là sắc ký cột nhanh (flash chromatography, FC) và sắc ký cột chân không (vacuum liquid chromatography, VLC). Cả hai đều sử dụng cột ngắn và đường kính lớn để tăng tốc độ dòng và tăng lượng mẫu. FC sử dụng áp suất dương thấp trên đầu cột còn VLC sử dụng áp suất âm ở cuối cột.

Trang bị cho sắc ký cột cổ điển rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các chất có trong thành phần hóa học của dược liệu. Hiện nay, sắc ký cột cổ điển và các kỹ thuật cải tiến của nó vẫn đóng vai trò chính trong việc chiết tách và phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu.

5.2.   Sắc ký lỏng áp suất trung bình

Để cải thiện khả năng phân tách các chất của sắc ký cột trong phân lập các chất, người ta sử dụng sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC).

MPLC được phát triển vào những năm 1980 sử dụng các cột chịu áp lực có kích thước tương tự như sắc ký cột cổ điển nhưng nhồi pha tĩnh loại hạt mịn (15 - 40µm). Cột được nhồi dưới áp suất nên có mật độ pha tĩnh cao hơn làm cho khả năng tách tốt hơn. Để có tốc độ dòng tối ưu, một áp suất không quá 40 bar, thường là 5 – 20 bar, tạo bởi một bơm nén được dùng để nén dòng dung môi chảy qua cột với tốc độ dòng có thể từ 3 ml/phút tới 60 -200 ml/phút tùy theo kích thước cột. Lượng mẫu thử cho MPLC có thể thay đổi từ vài chục mg tới 100g. Mẫu thử có thể được đưa trực tiếp lên đầu cột, sau đó nối với hệ thống bơm đẩy dung môi để triển khai hay bơm vào hệ thống qua hệ thống van bơm mẫu.

Pha tĩnh dùng trong MPLC là các pha tĩnh dùng trong sắc ký cột cổ điển (thường là silica gel) hay các loại pha đảo (RP) với kích thước tiểu phân thích hợp. Cột nạp các pha tĩnh RP có thể sử dụng lại nhiều lần. Việc thăm dò và lựa chọn hệ thống dung môi thích hợp cho MPLC có thể được tiến hành trên sắc ký lớp mỏng. Một hệ dung môi thích hợp cho MPLC là hệ dung môi có Rf các chất cần tách vào khoảng 0,3 trên sắc ký lớp mỏng. Với pha tĩnh RP, có thể sử dụng HPLC phân tích để thăm dò hệ dung môi.

Trên thực tế, một máy MPLC hiện đại thường có một hệ thống dung môi gồm bơm có thể thay đổi tốc độ dòng và các phụ kiện (chặn xung, gradient...); một hệ thống bơm mẫu với vòng lặp và van chuyển; cột MPLC, một detector UV, một máy tính để điều khiển thiết bị và ghi nhận kết quả; và một bộ hưng phân đoạn.

So với sắc ký cột cổ điển, hiệu năng tách của MPLC cao hơn. Hiệu năng tách của MPLC là trung gian giữa sắc ký cột cổ điển và sắc ký lỏng cao áp điều chế. So với HPLC điều chế, MPLC có thể sử dụng các cột lớn hơn nên có thể tách lượng mẫu nhiều hơn. Do các cột sắc ký là tự nhồi và chất nhồi cột là loại thông thường, dung môi không đòi hỏi chất lượng đặc biệt, thiết bị không quá phức tạp nên MPLC dễ áp dụng và kinh tế hơn so với HPLC điều chế.

5.3.   Sắc ký phân bố ngược dòng

Trong sắc ký cột cổ điển và MPLC, pha tĩnh sử dụng thường là các chất hấp phụ pha thuận tương đối rẻ tiền và thường chỉ sử dụng một lần. Các pha tĩnh này thích hợp với các chất từ kém phân cực tới phân cực trung bình. Trong những trường hợp phân tích các hỗn hợp phức tạp, các chất phân cực mạnh như glycosid có mạch đường dài, các polyphenol, các alcol, acid phân tử nhỏ v.v... pha tĩnh hấp phụ thường không cho kết quả tốt. Khi ấy, người ta thường sử dụng cơ chế phân bố để tách các chất. Các pha tĩnh phân bố sử dụng trong HPLC (thường là pha đảo) rất thích hợp trong những trường hợp này. Tuy nhiên, các pha tĩnh này thường đăt tiền, chỉ sử dụng trong sắc ký điều chế khi thật cần thiết. Để cải thiện khả năng phân tách các chất phân cực, người ta phát triển phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng (Countercurent chromatography, CCC).

Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp sắc ký trong đó cả pha tĩnh và pha động ở trạng thái lỏng. Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bố ngược dòng loại trừ được những khó khăn thường gặp trong các phương pháp sắc ký trên pha tĩnh rắn như mất mẫu hay phân hủy mẫu. Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp có khả năng tách các chất phân cực hiệu quả, hệ dung môi dùng cho cả pha tĩnh và pha động linh hoạt, rẻ tiền và có thể tiến hành trên phân tích lượng mẫu khá lớn trong thời gian tương đối ngắn.

Khác với HPLC hay các kỹ thuật sắc ký cột trên pha tĩnh lỏng mà trong đó pha tĩnh thường được giữ trên một giá mang rắn, pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng là một chất lỏng theo đúng nghĩa. Hai chất lỏng hay hỗn hợp chất lỏng không đồng tan này ‘dịch chuyển’ ngược chiều và tiếp xúc liên tục với nhau. Trong quá trình dịch chuyển, các chất trong hỗn hợp mẫu cần phân tích sẽ được hòa tan một cách cạnh tranh vào pha tĩnh và pha động. Mức độ hòa tan của chất giữa 2 pha phụ thuộc vào hệ phân bố của nó tronng 2 pha. Các chất có hệ số phân bố khác nhau sẽ phân bố vào pha động và pha tĩnh với những tỉ lệ khác nhau và trong quá trình dịch chuyển của pha động sẽ dần dần tách ra khỏi nhau.

Trong quá trình pha động dịch chuyển, sự phân bố các chất giữa 2 pha diễn ra, các chất trong hỗn hợp mẫu ( đuợc đưa vào ở 1 đầu của pha tĩnh) sẽ dịch chuyển dần về cuối pha tĩnh và tách ra khỏi nhau. Các chất có hệ số phân bố trong pha động lớn sẽ tách ra trước trong pha động và đi ra khỏi hệ thống trước tiên. Chất có hệ số k càng lớn sẽ ra càng sớm. Các chất có hệ số phân bố trong pha tĩnh lớn hơn cũng được tách ra khỏi nhau và dịch chuyển trong pha tĩnh về phía cuối cột. Đến một thời điểm nào đó, khi các chất tan nhiều trong pha động đã được tách ra khỏi hệ thống, người ta ngừng không đưa pha động vào nữa mà dùng pha tĩnh để đẩy phần chất lỏng trong hệ thống ra. Các chất đã tách ra trong pha tĩnh cũng sẽ được hứng thành từng phân đoạn riêng biệt. Các chất tách trong hệ càng tôt khi “số đĩa lý thuyết” của hệ càng lớn, tức là khi sự tiếp xúc giữa 2 dung môi và chiều dài của “cột” (pha tĩnh) càng lớn.

Hệ dung môi sử dụng trong sắc ký phân bố ngược dòng thường là hỗn hợp của 2 hay nhiều (thường không quá 4)dung môi có khả năng hòa tan hạn chế vào nhau. Khi tỉ lệ các dung môi này vượt quá giới hạn hòa tan, chúng sẽ tách thành 2 pha với tỉ lệ của các dung môi trong mỗi pha hoàn toàn khác nhau. Hai pha này sẽ được sử dụng làm pha động và pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng. Ví dụ, với hỗn hợp hai dung môi là n-butanol và nước ở 30⁰C, khi tỉ lệ hai dung môi vượt quá khả năng hòa tan vào nhau sẽ tách thành hai lớp chất lỏng riêng biệt là n-butanol bão hòa nước (với lượng nước là 7% kl/kl) và nước bão hòa n-butanol (với lượng n-butanol ~ 21% kl/kl).

Để một hỗn hợp chất lỏng có thể “đứng yên” làm pha tĩnh, người ta cần có những thiết bị đặc biệt. Thiết bị tách phân bố đơn giản nhất được sử dụng tách các hỗn hợp chất là thiết bị Phân bố ngược dòng (Countercurrent distribution – CCD) được L. C. Craig thiết kế vào những năm 1940. Thiết bị gồm nhiều bộ phận là những ống bằng thủy tinh có thiết kế đặc biệt để chứa pha tĩnh và pha động, khi vận hành có thể chuyển pha động từ ống này sang ống khác. Mỗi ống chiết đuợc xem như một đĩa lý thuyết. Nhược điểm của thiết bị này là số đĩa không nhiều nên khả năng tách tương đối hạn chế và thiết bị tương đối cồng kềnh. Ngày nay, có một số thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng với số đĩa lý thuyết lớn hơn, gọn và dễ sử dụng hơn đang được sử dụng trong các phòng thí nghiệm.

Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ (Droplet countercurrent chromatography – DCCC) được Yoichiro Ito và cộng sự giới thiệu vào những năm 1970. DCCC sử dụng những ống nhỏ có đường kính trong 2 -4 mm và chiều dài 40cm. Các ống này (khoảng 300 ống) được xếp đứng song song với nhau và nối với nhau qua hệ thống ống teflon với đầu ống này nối vào cuối ống kia. Pha động được dịch chuyển qua pha tĩnh dưới dạng những hạt nhỏ nổi lên hay chìm xuống trong pha tĩnh (tùy thuộc vào pha động nặng hơn hay nhẹ hơn pha tĩnh). Nhược điểm của DCCC là tốc độ chậm và hiệu quả tách chưa cao do sự tiếp xúa kém giữa 2 pha.

Sắc ký phân bố ly tâm (Centrifugal partition chromatography –CPC) hay còn gọi là Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ ly tâm (Centrifugal droplet countercurrent chromatography – CDCCC) cũng tương tự như DCCC nhưng dòng pha động có thể được bơm vào với tốc độ cao hơn ( có thể tới 100 lần so với DCCC) nhờ tác động của lực ly tâm. Thiết bị gồm các ống polymer chịu dung môi (như teflon) nối với nhau giống như DCCC nhưng được sắp xếp theo hướng từ tâm ra ngoài của 1 trục quay. Khi vận hành, các ống được quay quanh trục và lực ly tâm sẽ giữ chop ha tĩnh trong ống. Pha tĩnh được bơm vào hệ thống theo hướng từ tâm ra ngoài với pha động nặng hơn hay ngược lại với pha tĩnh nhẹ hơn. Do khả năng tiếp xúc giữa 2 dung môi tốt hơn nên CDCCC có số đĩa lý thuyết lớn hơn. Tốc độ phân tách của CPC cũng nhanh hơn so với DCCC.

Hệ thống sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (High speed countercurrent chromatography – HSCCC) là hệ thống được Y. Ito phát triển vào những năm 1980 và được sử dụng nhiều hiện nay trong các thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng do hiệu quả phân bố cao và tốc độ phân tách nhanh. Cũng giống như DCCC, HSCCC sử dụng lực ly tâm để giữ một chất lỏng trong hệ thống làm pha tĩnh và chất lỏng còn lại được bơm vào hệ thống làm pha động. Thiết bị HSCCC bao gồm 1 ống nhựa teflon với 1 đầu của ống được dùng làm đầu vào còn đầu kia là đầu ra của hệ thống. Đầu vào và đầu ra của hệ thống có thể đảo ngược tùy theo pha động là nặng hay nhẹ hơn so với pha tĩnh. Ống này được cuộn xoắn lại theo kiểu lò xo hay xoắn ốc, vừa có thể quay quanh trục của nó đồng thời được sắp xếp để có thể quay quanh 1 trục chung theo kiểu chuyển động của hành tinh quanh mặt trời. Tùy theo thiết kế mà thiết bị có số lượng cuộn và cách sắp đặt các cuộn có khác nhau. Trong đó, loại thiết bị có cách sắp xếp các cuộn xoắn theo ‘kiểu J’ phổ biến và được sử dụng nhiều nhất.

Trong phân lập các chất trong dược liệu, để việc phân lập hiệu quả hơn, đặc biệt là với các hỗn hợp phức tạp và có cấu trúc gần giống nhau, người ta thường sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký với các cơ chế tách khác nhau. Ví dụ, như phân tách cao chiết thành các phân đoạn đơn giản hơn bằng các phương pháp sắc ký cột cải tiến (FC, VLC) sau đó tách bằng sắc ký cột cổ điển với các loại pha tĩnh khác nhau, sắc ký rây phân tử, MPLC và HPLC điều chế. Việc áp dụng các phương pháp nên đi dần từ đơn giản đến phức tạp, từ các phương tiện, pha tĩnh rẻ tiền tới các loại có giá thành cao.