Sắc ký khí

4. Sắc ký khí

 

Sắc ký khí là phương pháp sắc ký mà pha động lỏng được thay bằng một dòng khí liên tục chạy qua pha tĩnh. Các chất được tách ra khỏi hỗn hợp bởi tương tác khác nhau của chúng với pha tĩnh. Do khả năng hòa tan rất kém của chất khí, dòng khí này không đóng vai trò của một pha động thực sự trong hệ thống sắc ký. Nó chỉ làm nhiệm vụ lôi cuốn các chất trong pha hơi chạy dọc theo pha tĩnh để chúng có thể tương tác với pha tĩnh. Vì thế, dòng khí chạy trong cột sắc ký khí chỉ được gọi là khí mang. Đóng vai trò đẩy các chất ra khỏi pha tĩnh trong sác ký khí chính là nhiệt độ. Các chất có nhiệt độ sôi khác nhau sẽ bị lưu giữ hay bị lôi cuốn bởi dòng khí mang khác nhau. Từ đó các chất tách ra khỏi nhau. Do phải được hóa hơi để có thể được lôi cuốn đi bởi dòng khí mang, chỉ những chất bay hơi mới có thể được phân tách. Vì vậy, sắc ký khí chỉ áp dụng được cho các chất có khả năng bay hơi ở nhiệt độ tiến hành sắc ký.

Cấu tạo của một hệ thống sắc ký khí hiện đại bao gồm những thành phần chính sau: (a) Khí mang và hệ thống điều chỉnh khí, (b) cổng bơm mẫu và thiết bị bơm mẫu, (c) cột sắc ký, (d) buồng cột, (e) detector và (f) máy tính dùng để điều khiển thiết bị, ghi nhận và lưu trữ kết quả.

4.1. Khí mang và hệ thống điều chỉnh khí

Các khí mang thông dụng nhất là nitơ và heli. Nitơ rẻ tiền và sẵn có hơn so với heli. Heli cho hiệu quả tách thường cao hơn. Khí mang phải không được có các khí lạ khác ảnh hưởng tới phân tích như tương tác với các chất phân tích, với pha tĩnh hay tạo nên các peak lạ trong sắc ký đồ. Độ tinh khiết của các khí thông thường phải cao hơn 99,95%. Các chất không được phép có trong khí mang là oxy, khí carbonic, hơi nước và các halogen. Chúng phải được lọc trước khi đưa vào hệ thống sắc ký bởi hệ thống lọc.

Để có được tốc độ dòng tối ưu, một hệ thống đo và điều chỉnh áp suất, lưu lượng khí được sử dụng. Hệ thống này cho phép điều chỉnh lưu lượng/áp suất dòng khí vào cột một cách chính xác theo yêu cầu phân tích.

4.2. Cổng bơm mẫu và thiết bị bơm mẫu

Là nơi mẫu dưới dạng lỏng được bơm vào hệ thống. Cổng bơm mẫu được gia nhiệt để cho tất cả các thành phần trong mẫu lỏng được hóa hơi và đi vào hệ thống. Với sác ký khí mao quản, lượng mẫu thường không vượt quá 10 ml. Với sắc ký khí cột nhồi, lượng mẫu bơm có thể lớn hơn. Toàn bộ lượng mẫu bơm vào sau khi được hóa hơi có thể đi vào cột sắc ký (bơm mẫu không chia dòng) hay chỉ một lượng nhất định hơi đi vào cột phân tích, phần còn lại được đẩy ra ngoài (bơm mẫu chia dòng).

Có thể bơm mẫu vào cổng bơm mẫu bằng tay với một xylanh. Người ta cũng có thể tự động hóa bằng một bộ phận bơm mẫu tự động. Trong kỹ thuật head space, mẫu được hóa hơi trong một chai đựng mẫu kín rồi được bơm vào hệ thống sắc ký dưới dạng khí.

4.3. Cột sắc ký

Dạng cổ điển nhất của cột sắc kýkhí là cột nhồi với một cột thủy tinh hay thép không rỉ hở hai đầu có đường kính trong 2 - 4 mm, dài 1 - 4 m, bên trong nhồi đầy pha tĩnh. Tuy nhiên, ngày nay phần lớn (trên 90%) các cột sắc ký khí là mao quản. Cột mao quản thường được làm bằng silica nung chảy có đường kính  trong từ 0,1 - 0,53 mm với chiều dài 10 - 100 m hay hơn. Các cột thông thường có đường kính trong 0,2 mm, 0,25 mm hay 0,32 mm vời chiều dài 25 - 60 m. Thành trong của cột mao quả có thể tráng lên một lớp pha tĩnh lỏng với bề dày 0,2 - 5 mm (wall coated open tubular, WCOT) hay được phủ một lớp hạt có một lớp pha tĩnh lỏng bao quanh (support coated open tubular, SCOT) hoặc một lớp pha tĩnh xốp của chát hấp phụ hay rây phân tử (porous layer open tubular, PLOT)... loại cột mao quản thông dụng nhất hiện nay là WCOT. So với cột nhồi, cột mao quản có hiệu năng tách cao hơn rất nhiều. Một cột mao quản 60 m có thể có 180.000 - 300.000 đĩa lý thuyết so với 4000 đĩa lý thuyết của cột nhồi )2m). Loại cột nhồi có đường kính nhỏ hơn (microbore; 0,75 mm) được xem như là dạng trung gian giữa cột nhồi và mao quản.

Pha tĩnh trong sắc ký khí cũng khá đa dạng. Các pha tĩnh rắn với cơ chế hấp phụ (silacagel, nhôm oxyd), rây phân tử hay gặp trong cột nhồi. Tuy nhiên, pha tĩnh phổ biến nhất là pha tĩnh lỏng theo cơ chế phân bố. Pha tĩnh lỏng có thể được phủ lên một giá mang trong cột nhồi hay tráng lên thành trong của cột mao quản.

Lượng pha tĩnh trong cột càng lớn, khả năng tách và lượng mẫu có thể phân tích của cột càng cao. Trong cột nhồi, lượng pha tĩnh có thể chiếm tới 25% khối lượng của vật liệu nhồi cột.

Các chất lỏng sử dụng làm pha tĩnh cũng khá đa dạng về nguồn gốc và độ phân cực. Hai loại pha tĩnh thông dụng nhất là dẫn chất của polysiloxan và polyethylen glycon. Các dẫn chất polysiloxan (methyl polysiloxan, các hỗn hợp của methyl polysiloxan, phenyl polysiloxan và cyano polysiloxan) có độ phân cực từ kém tới trung bình. Các polyethylen glycon là pha tĩnh phân cực. Tên gọi của pha tĩnh khác nhau theo hãng sản xuất như OV, SE hay DB... cho các loại dẫn chất polysiloxan, Carbowax, CP-wax hay DB-wax... cho polyethylen glycon với các chữ số đứng sau để chỉ loại polysiloxan hay polyethylen glycon sử dụng. Các pha tĩnh khác như dầu apiezon, squalen, các alcol có độ sôi cao và những ester của chúng... cũng được sử dụng. Mỗi pha tĩnh đề có những nhiệt độ giới hạn của chúng, vượt quá nhiệt độ này sẽ làm pha tĩnh mau hư hỏng. Các dẫn chất polysiloxan, nhiều độ thường không được quá 340 - 360⁰C, còn với polyethylen glycon, nhiệt độ thường không được quá 250⁰C.

4.4. Buồng cột

Nhiệt độ là một yếu tố có ý nghĩa quan trọng trong việc tách các chất của quá trình sắc ký khí. Trong suốt quá tình phân tích, nhiệt độ của cột phải đồng đều trên tòan bộ cột. Nhiệt độ cột phải ổn định, chính xác và thay đổi được theo yêu cầu phân tích. Phân tích sắc ký khí có thể được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt (isothermal) hay nhiệt độ tăng dần theo chương trình nhiệt (gradient). Để đạt được điều này, toàn bộ cột sắc ký được đặt trong một khoang kín được gọi là buồng cột. Buồng cột được cách nhiệt và có các thiết bị gia nhiệt, theo dõi nhiệt độ và phân phối nhiệt, giữ cho nhiệt độ cột phân tích đồng đều, ổn định và tuân theo yêu cầu phân tích.

4.5. Detector

Có nhiều loại detector khác nhau sử dụng trong sắc ký khí. Detector phổ biến nhất hiện nay là detector ion hóa ngọn lửa (flame ionization detector, FID), đây là loại detector phổ thông, phát hiện được hầu hết các chất phân tích, nhạy và có khoảng tuyến tính động học khá rộng, thích hợp cho việc định lượng. Loại này có thiết kế đơn giản và cũng tương đối rẻ tiền. Detector MS với nhiều kỹ thuật đo khác nhau ngày càng trở nên phổ biến hơn vì tính hiệu dụng của nó. Nó phát hiện được rất nhiều chất những cũng là một detector rất chọn lọc khi sử dụng kỹ thuật phát hiện chọn lọc ion. Phổ khối có độ nhạy cao và khoảng tuyến tính động học lớn thích hợp cho việc định lượng. Detector MS còn cung cấp những thông tin hữu ích về khối lượng phân tử và các phân mảnh để xác định cấu trúc các chất.

Ngoài ra, còn có các detector phổ thông hay đặc hiệu khác thích hợp cho từng nhóm hợp chất. Tuy nhiên, các detector này ít phổ biến.

Để xác định một chất nào đó, ngòai thời gian lưu (t_r), người ta còn sử dụng chỉ số lưu Kovats (hay còn được gọi là chỉ số Kovats hay chỉ số lưu). So với t_r, chỉ số lưu Kovats ổn định hơn do bù trừ được những sai lệch do thiết bị và điều kiện phân tích. Để xác định chỉ số lưu Kovats của một chất, người ta tiến hành sắc ký chất đó với 2 chất chuẩn là hydrocarbon được chọn sao cho một chất được rửa giải trước và chất còn lại được rửa giải ra sau là chất xác định. Chỉ số Kovats được tính dựa trên mối liên hệ (logarit) của thể tích lưu (thời gian lưu) hiệu chỉnh của chất đó với 2 chất chuẩn.

Sắc ký khí là phương pháp có hiệu năng tách rất cao, cao hơn nhiều so với HPLC. nó có thể phân tích những hỗn hợp rất phức tạp mà HPLC không phân tích nổi.

Tuy nhiên, nhược điểm của sắc ký khí là phương pháp này chỉ có thể sử dụng cho phân tích các chất bay hơi. Các chất không bay hơi ở nhiệt độ phân tích (thường không quá 300⁰C) muốn phân tích được cần phải biến đổi thành dẫn chất bay hơi bằng cách ethyl hóa (methyl hóa, tolyl hóa, silyl hóa). Điều này làm hạn chế khả năng ứng dụng của sắc ký khí. Mặc dù vẫn có thể sử dụng trong sắc ký điều chế nhưng trên thực tế, sắc ký khí gần như chỉ dùng trong phân tích định tính và định lượng.

Trong phân tích dược liệu, sắc ký khí rất thích hợp cho phân tích tinh dầu và các chất bay hơi. Đặc biệt, khi kết hợp với phổ khối kế và thư viện phổ, hệ thống GC-MS có thể phân tích và cho biết thành phần của tinh dầu và các chất bay hơi rất nhanh và hiệu quả. Các kết quả phân tích khối phổ trên hệ thống sẽ được so sánh với một cơ sở dự liệu về khối phổ ESI-MS (được gọi là thư viện phổ) để xác định các chất phân tích.

Có nhiều thư viện phổ khác nhau nhưng lớn và thường được sử dụng nhất là thư viện phồ NIST. Hiện nay là phiên bản NIST-08 của Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia, Mỹ (National Institute of Standards & Technology). Thư viện có 220.460 phổ khối EI-MS của 192.108 hợp chất thuộc các nhóm: (a) Thuốc, chất chuyển hóa và chất độc, (b) Thuốc trừ sâu và trừ nấm, (c) các chất hữu cơ trong đất, nước và không khí, (d) aminoacid, di- và tri-peptid, (e) các tạp chất thông thường và (f) các dẫn chất phân tích của các nhóm trên. Thư viện còn có 14.802 phồ MS/MS của 5.308 ion (3.898 cation và 1.410 anion) và 224.308 chỉ số lưu Kovats của 21.847 chất trên cả cột không phân cực và phân cực.

Một ứng dụng khác hiện nay cũng được quan tâm là phân tích dư lượng các chất bảo vệ thực vật còn lại trên dược liệu, dioxin và các chất độc hại trong thực phẩn, lượng dung môi tồn dư của thuốc, các chất ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe con người (các hợp chất thơm đa vòng...). Các chất này thường tồn tại vời một lượng rất nhỏ trong hỗn hợp phức tạp, rất khó để phát hiện, định danh cũng như định lượng chúng bằng các phương pháp sắc ký khác.