SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPTLC)

SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPTLC)

Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc.

Nguyên tắc: Về nguyên tắc cơ bản không khác nhiều với sắc ký lớp mỏng thông thường. HPTLC Linomat 5. Điểm khác chủ yếu là quá trình chấm sắc ký được điều khiển và thực hiện bằng máy, số vết, lượng dịch chiết sẽ chấm trên bản mỏng được xác lập trên máy vi tính HPTLC computer. Quá trình chấm dịch chiết thực hiện với sự hỗ trợ của máy nén khí hoặc bình khí nén N. Sau khi triển khai, sắc ký đồ được chụp ảnh qua buồng chụp (reprostar 3) và kết quả được đánh giá bằng phần mềm Videoscan.

Cách tiến hành:

Dụng cụ

HPTLC Chamber Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng và có nắp đậy kín (Với hệ thống CAMAG các dụng cụ này được trang bị sẵn).

Bình triển khai sắc ký lớp mỏng

Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 366 nm (Trong hệ thống).

Buồng đèn tử ngoại

HPTLC sprayn Dụng cụ để phun thuốc thử.

Dụng cụ phun thuốc thử

Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.

Tủ hút hơi độc.

Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.

Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro)  có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30 – 50 cm.

Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.

Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp.

Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp. Chuẩn bị bình khai triển: Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 – 25^oC.

 Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng những dung môi thật tinh khiết, loại dùng cho sắc ký. Những dung môi dễ bịến đổi về hóa học chỉ nên pha trước khi dùng. Nếu sử dụng những hệ pha động phức tạp phải chú ý đến những thành phần dễ bay hơi làm thay đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại của trị số R_f.

HPTLC Reprosta3 Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản mỏng có ý nghĩa quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc bịệt ảnh hưởng rất lớn đến trị số R_f. Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số R_fgần nhau sẽ bị chồng lấp. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005 mg). Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 – 50 mg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l – 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế. Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 – 50 mg. Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm.

Máy chấm sắc ký lớp mỏng điều khiển bằng máy tính

Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm – 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 – 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 – 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích dung dịch chấm lên bản mỏng. Do đó, với những trường hợp phân tích bán định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không cần định lượng dùng micropipet hoặc ống mảo quản thường.

Triển khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng. Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị R_f hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định trong chuyên luận riêng.

Sắc ký đồ một số dịch chiết dược liệu