CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU
I. CHIẾT XUẤT
Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:
- Sự hòa tan của chất tan vào dung môi.
- Sự khuyếch tán của chất tan trong dung môi.
- Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật.
Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu...) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất.
Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểm tra về mặt thực vật xem có đúng loài, đôi khi còn đúng thứ hay chủng mà ta cần hay không. Cần ghi rõ nơi thu hái, thời gian thu hái. Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề về thời vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất. Dược liệu sau đó có thể làm khô hoặc để tươi mà chiết. Nhiều hoạt chất rắn rất dễ bị biến đổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzym (xem phần ổn định dược liệu). Kích thước của bột dược liệu cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết.
Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương pháp chiết trên như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng); chiết với các thiết bị như soxhlet, kumagawa... tùy yêu cầu, điều kiện mà lực chọn kỹ thuật chiết thích hợp.
Các phương pháp chiết gồm có ngâm và chiết kiệt. Trong phương pháp ngâm dược liệu được ngâm trong 1 lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu. Trong phương pháp ngấm kiệt, dung mội được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với 1 tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn.
Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại họat chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosic, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong cồn sôi vừa để diệt enzym vừa để hòa tan hoạt chất.
Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao v.v... đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất.
Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu âm với tần số trên 20 KHz thường được sử dụng. Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuyếch tán chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết.
Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được sử dụng tng chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Soxhlet cổ điển. Khi đó, người ta nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết. Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên. Tuy nhiên, người ta cũng có thể gia nhiệt để quá trình chiết được nhanh hơn. Trong chiết xuất ở quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu. Do khả năng xuyên sâu kém nên việc sử dụng thường ở quy mô phòng thí nghiệm.
Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vòng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường. Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống.
Trong chiết xuất, trong chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi. Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hòa tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn.
Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuất dược liệu ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho chiết xuất truyền thống (như chiết bằng Soxhlet) do rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài chục giây tới 15-20 phút. Cũng đã có những thiết bị chiết vi sóng ở quy mô lớn. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng cũng có nhược điểm đó là các tạp chất trong dịch chiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp tiếp theo. Thiết bị chiết hỗ trợ bằng vi sóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước. Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm lượng tinh dầu thu được thường cao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn. Cũng có báo cáo về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương pháp này như chiết saponin, anthraquinon, alkaloid...
Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ đa chấp thuận sử dụng kỹ thuật vi sóng trong việc chuẩn bị mẫu cho phân tích các chất hữu cơ trong phân tích môi trường (EPA Method 3546).
Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn
Những năm gần đây phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá tới hạn (super-critical fluid extraction,SFC) cũng được áp dụng để chiết xuất trong định tính cũng như công nghiệp các hợp chất tự nhiên.
Nguyên tắc của phương pháp này như sau: trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng.
Điểm (ứng với nhiệt độ và áp suất) mà một chất chuyển từ trạng thái hơi sang trạng thái lỏng này được gọi là điểm tới hạn (critical point) của chất đó. Điểm tới hạn của nước có nhiệt độ tới hạn (tc) và áp suất tới hạn (pc) tương ứng là 374,20C và 220,5 bar, với carbon dioxid tc = 31,10C và pc = 73,8 bar, với ethanol tc = 243,40C và pc = 72 bar.
Do mang cả đặc tính của chất khí và chất lỏng nên chất lỏng quá tới hạn có khả năng hòa tan các chất đồng thời có độ nhớt thấp và khả năng khuếch tán cao có thể dùng để hòa tan các chất và ứng dụng vào chiết xuất các chất trong dược liệu. Các đặc tính của chất lỏng quá tới hạn (khả năng hòa tan các chất, độ nhớt...) phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất. Thay đổi các điều kiện này sẽ làm thay đổi đặc tính (độ phân cực, khả năng hòa tan) của chất lỏng quá tới hạn. Trong thực tế, người ta thực hiện chiết trong điều kiện cao hơn điểm tới hạn một ít.
Chất lỏng thông dụng nhất hiện nay là CO2 lỏng quá tới hạn. CO2có điểm tới hạn thấp, rẻ tiền, không độc hại và thân thiện với môi trường, có thể thu hồi, không làm tăng hiệu ứng nhà kính. Khi chiết xuất hoạt chất từ dược liệu, CO2 lỏng quá tới hạn có lợi hơn các dung môi hữu cơ thông thường ở chỗ ít độc hại, nâng cao hiệu suất và không để lại dư lượng dung môi trong cao chiết. Ngoài ra quá trình chiết xuất có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp nên không làm biến đổi những thành phần kém bền với nhiệt độ.
Một trong những nhược điểm của SFE là tính phân cực của CO2 lỏng quá tới hạn. Ở các điều kiện chiết thông thường, CO2 lỏng quá tới hạn là một dung môi kém phân cực, do đó chỉ có thể dung để chiết các chất kém phân cực. Để cải thiện khả năng hòa tan các chất phân cực hơn, trong quá trình chiết xuất, người ta thêm vào CO2 lỏng quá tới hạn một lượng nhất định một dung môi phân cực (như methanol) để thay đổi tính phân cực của dung môi để chiết các chất phân cực hơn.
Chiết chất lỏng quá tới hạn hiện nay được ứng dụng trong nhiều ngành ở quy mô công nghiệp (từ những năm 1978), trong nghiên cứu và phân tích kiểm nghiệm. Trong pạm vi nghiên cứu cây thuốc, tác giả đầu tiên ứng dụng nghiên cứu này là Stahl và cộng sự [Planta Med. , 1980, 40, 12]. Các nhóm hợp chất thích hợp nhất để chiết bằng chất lỏng quá tới hạn là tinh dầu, chất béo, carotenoid và các chất kém phân cực khác. Với tinh dầu, việc chiết bằng CO2 lỏng quá tới hạn cho hiệu suất chiết cao, thời gian chiết ngắn và không làm hư hỏng các chất nhạy cảm với nhiệt độ. Tinh dầu thu được có hương thơm gần với tự nhiên nhất. Người ta dung carbon dioxyd và nitrogen oxyd hóa lỏng để chiết xuất nhiều loại hoạt chất trong cây như alcaloid ví dụ loại cafein trong hạt Cà phê, chiết những thành phần của hoa cây Dương cam cúc – Matricara chamomilla, hoa Cúc trừ sâu – Pyrethrum cinerariifolium... Bằng phương pháp chiết này hiệu suất pyrethrin được nâng lên đến 50% so với phương pháp chiết bằng ether dầu. Trong phòng thí nghiệm, SFE được dung để chiết mẫu cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu, các chất hữu cơ độc hai trong môi trường...
Chiết dưới áp suất cao
Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết suất hiện đại là chiết dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction – PLE). Khả năng hòa than của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế, trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giả thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới áp suất.
Khi nhiệt độ tăng lên 100C, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi. Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80 – 2000C và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết.
So với SFE, PLE có sự linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi do đó có thể chiết các chất trong một giới hạn rộng hơn về độ phân cực. Các thiết bị cũng không cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt như SFE nên dễ dàng áp dụng thực tế trên quy mô lớn.
PLE cũng đã được sử dụng chính thức trong các quy trình chuẩn bị mẫu phân tích các thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu và các hdrocarbon thơm đa vòng... của cơ quan bảo vệ môi trường (EPA Method 3454).
Trong nghiên cứu và sản xuất dược liệu, PLE đã được sử dụng để chiết ở quy mô phòng thí nghiệm, chuẩn bị mẫu phân tích hay chiết các chất ở quy mô lớn. Ví dụ, chiết dioxin bằng toluen hoặc toluen + 5% acid acetic (1500C, 150 bar), chiết chất béo trong các hạt dầu bằng n-hexen (1000C, 100 bar), chiết hypericin trong Hypericum perforatum bằng acetonitril (1000C, 100 bar).
Một biến thể của PLE cũng được áp dụng trong chiết xuất dược liệu là chiết bằng nước nóng dưới áp suất (pressurized hot water extraction, PHWE). Do diểm tới hạn của nước khá cao nên trong PHWE người ta dùng áp suất thấp hơn nhiều (chỉ vào khoảng 20 bar) ở nhiệt độ thay đổi từ trên 100 - 2000C. Đặc tính (độ phân cực) của nước thay đổi rất nhiều trong điều kiện này làm cho nước có thể chiết được các chất kém phân cực hơn. Trong PHWE, sự phân hủy các chất có thể xảy ra.
II. PHÂN LẬP CÁC HOẠT CHẤT
Phân lập là tách riêng một chất dưới dạng tinh khiết ra khỏi một hỗn hợp. Thành phần của một dược liệu thường rất phức tạp, trong nhiều trường hợp, chỉ một hoặc vài chất trong hỗn hợp toàn phần của dược liệu được sử dụng làm thuốc, ví dụ, strychnin trong hạt Mã tiền, vincristin và vinblastin trong Dừa cạn, paclitaxen trong Taxus, quinin và quinidin từ Canh kina... Để tách riêng hoạt chất hoặc trong nghiên cứu muốn tách riêng các chất để xác định cấu trúc, làm chất chuẩn, nghiên cứu dược lý... người ta cần tiến hành phân lập từng chất dưới dạng tinh khiết.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để phân lập các chất từ một hỗn hợp. Có các phương pháp kinh điển như các phương pháp kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn hay các kỹ thuật sắc ký hiện đại v.v...
1. Kết tinh phân đoạn
Phương pháp dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất khi hòa tan hỗn hợp vào một hoặc một hỗn hợp dung môi. Trong quá trình để yên để dung môi bốc hơi từ từ, thành phần khó tan nhất sẽ tủa hoặc kết tinh trước. Lọc lấy phần tinh thể thô và kết tinh lại sẽ thu được chất tinh khiết. Phần dung dịch còn lại có thể để bay hơi dung môi và kết tinh để tách các chất khác. Có thể kết hợp việc bay hơi dung môi với giảm nhiệt độ để quá trình kết tinh hiệu quả hơn. Dung môi dùng để hòa tan/kết tinh phân đoạn thường là một dung môi nhưng cũng có thể là một hỗn hợp 2 hay 3 dung môi trong trường hợp các chất khó kết tinh. Đối với một số nhóm chất đặc biệt, để phân lập người ta tạo ra các dẫn chất ít tan ví dụ tạo muối picrat alcaloid, tạp osazon các đường để các chất dễ kết tinh hơn.
2. Tách phân đoạn
Đối với một vài nhóm chất, người ta có thể tách riêng từng phân đoạn khỏi hỗn hợp dựa vào lý hóa tính khác nhau của các chất thành phần như độ hòa tan trong các dung môi, tính acid hay base và độ mạnh của tính acid hay base. Ví dụ, một hỗn hợp muối alcaloid trong nước, khi kiềm hóa từ từ thì alcaloid có tính kiềm yếu nhất sẽ được giải phóng ra dạng tự do trước, nếu kiềm hóa tiếp thì lần lượt các alcaloid có tính kiềm mạnh hơn sẽ được tiếp tục giải phóng. Nếu ta dùng dung môi hữu cơ để chiết sau từng giai đoạn thì sẽ thu được các alcaloid khác nhau. Cũng như vậy đối với một hỗn hợp acid hữu cơ dưới dạng muối sẽ được giải phóng từng phân đoạn khi thêm từ từ acid vô cơ rồi chiết bằng dung môi hữu cơ.
3. Thăng hoa
Một số chất hay nhóm hợp chất có thể thăng hoa được như các coumarin và anthranoid ở dạng tự do (aglycon); cafein, ephedrin, camphor, borneol... có thể được tách ra khỏi hỗn hợp hay được tinh chế bằng cách cho thăng hoa. Quá trình thăng hoa có thể được thực hiện ở áp suất thường hay áp suất giảm. Khi thăng hoa dưới áp suất giảm, nhiệt độ thăng hoa của các chất giảm làm giảm bớt tác động phân hủy của nhiệt độ lên các chất. Với các dụng thăng hoa dưới áp suất giảm có thể theo dõi áp suất và nhiệt độ người ta có thể thăng hoa cả những chất khó hay không thực hiện được bằng cách thăng hoa ở áp suất thường. Với dụng cụ này người ta có thể phân lập, tinh chế một số alcaloid, flavonoid...
4. Chưng cất phân đoạn
Chưng cất phân đoạn là một trong những phương pháp kinh điển dùng để tách các chất bay hơi ra khỏi một hỗn hợp dựa vào sự khác biệt nhiệt độ sôi của các chất trong hỗn hợp. Quá trình chưng cất có thể thực hiện ở áp suất khí quyển hay áp suất giảm. Phương pháp chưng cất phân đoạn được thực hiện với những bình cất có lắp cột phân đoạn và thường được nối với máy hút chân không để giảm nhiệt độ chưng cất, giảm ảnh hưởng tới các chất nhạy cảm với nhiệt độ. Nhiệt độ và áp suất được theo dõi trong quá trình chưng cất. Phương pháp này thường áp dụng để tách các chất thành phần của tinh dầu.
5. Các phương pháp sắc ký
Sắc ký điều chế là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các chất tự nhiên. Thành phần của các dịch chiết thực vật thường rất phức tạp, thường vài chục chất. Tính chất của các chất cần tách cũng rất thay đổi, từ các chất không hay rất kém phân cực tới các chất phân cực mạnh, từ các chất phân tử nhỏ tới các đại phân tử. Hàm lượng các chất trong hỗn hợp cũng rất thay đổi, từ vài % tới phần nghìn hay thậm chí hơn trong một số trường hợp. Trong các trường hợp như vậy, các phương pháp phân lập cổ điển như kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn v.v... không thể đáp ứng được. Khi đó, các kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng áp suất trung bình, sắc ký lỏng cao áp điều chế và sắc ký ngược dòng sẽ là các kỹ thuật được lựa chọn sử dụng. Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng cao áp điều chế, về mặt lý thuyết và thiết bị đã được đề cập tới ở phần các phuơng pháp đánh giá dược liệu. Dưới đây là một số kỹ thuật sắc ký khác, đặc trưng cho phân lập các chất thường sử dụng trong nghiên cứu dược liệu.
5.1. Sắc ký cột
Sắc ký côt là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột hình trụ hở 2 đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đường kính trong rất hẹp. Theo nghĩa rộng, sắc ký cột bao gồm cả sắc ký cột cổ điển dùng trong điều chế các chất và sắc ký cột hiện đại thường dùng trong phân tích như HPLC, GC... ở đây chỉ trình bày các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển. Với kích thước cột lớn, sắc ký cột cổ điển chủ yếu được dùng trong việc chiết tách và phân lập các chất.
Trong sắc ký cột cổ điển, người ta thường dùng các cột thủy tinh đường kính 1 - 5cm dài 30 – 100cm để nhồi pha tĩnh. Chất nhồi cột có kích thước từ 15 - 300µm. Kích thước hạt càng lớn, dung môi qua cột càng dễ dàng nhưng hiệu năng tách kém. Với vật liệu nhồi cột là Silica gel dùng cho sắc ký cột, người ta thường phân ra làm 3 loại là loại mịn (15 - 40µm), loại vừa (40 - 63µm) và loại thô (63 - 200µm). Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp của mẫu và khả năng tách của hệ thống. Tỉ lệ mẫu / pha tĩnh thường là 1/30 – 1/100 hay hơn. Trong 1 vài kỹ thuật, tỉ lệ này có thể tăng tới 1/10.
Cột sẽ được triển khai bằng dung môi thích hợp. Dung môi có các chất được tách ra sẽ đi ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bằng bộ phận hứng phân đoạn. Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và những phân đoạn giống nhau được gộp chung, loại dung môi để thu được chất tinh khiết. Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, các băng chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các “khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất.
Trong sắc ký cột cổ điển, áp lực đẩy dòng dung môi qua cột là áp suất thủy tĩnh. Với cột dài và chất nhồi cột mịn, tốc độ dòng dung môi giảm có thể ảnh hưởng đến kết quả sắc ký do hiện tượng khuyếch tán. Thời gian khai triển cũng rất dài, có khi là nhiều ngày hay hơn. Để khắc phục phần nào nhược điểm này, một số kỹ thuật sắc ký cột cải tiến đã được sử dụng giúp giảm thời gian phân tách. Tuy nhiên, hiệu lực tách của cột cũng có thể giảm. Khi ấy người ta thường thu các phân đoạn đơn giản để tiếp tục phân tách trên các cột sắc ký khác. Hai kỹ thuật hay sử dụng là sắc ký cột nhanh (flash chromatography, FC) và sắc ký cột chân không (vacuum liquid chromatography, VLC). Cả hai đều sử dụng cột ngắn và đường kính lớn để tăng tốc độ dòng và tăng lượng mẫu. FC sử dụng áp suất dương thấp trên đầu cột còn VLC sử dụng áp suất âm ở cuối cột.
Trang bị cho sắc ký cột cổ điển rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các chất có trong thành phần hóa học của dược liệu. Hiện nay, sắc ký cột cổ điển và các kỹ thuật cải tiến của nó vẫn đóng vai trò chính trong việc chiết tách và phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu.
5.2. Sắc ký lỏng áp suất trung bình
Để cải thiện khả năng phân tách các chất của sắc ký cột trong phân lập các chất, người ta sử dụng sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC).
MPLC được phát triển vào những năm 1980 sử dụng các cột chịu áp lực có kích thước tương tự như sắc ký cột cổ điển nhưng nhồi pha tĩnh loại hạt mịn (15 - 40µm). Cột được nhồi dưới áp suất nên có mật độ pha tĩnh cao hơn làm cho khả năng tách tốt hơn. Để có tốc độ dòng tối ưu, một áp suất không quá 40 bar, thường là 5 – 20 bar, tạo bởi một bơm nén được dùng để nén dòng dung môi chảy qua cột với tốc độ dòng có thể từ 3 ml/phút tới 60 -200 ml/phút tùy theo kích thước cột. Lượng mẫu thử cho MPLC có thể thay đổi từ vài chục mg tới 100g. Mẫu thử có thể được đưa trực tiếp lên đầu cột, sau đó nối với hệ thống bơm đẩy dung môi để triển khai hay bơm vào hệ thống qua hệ thống van bơm mẫu.
Pha tĩnh dùng trong MPLC là các pha tĩnh dùng trong sắc ký cột cổ điển (thường là silica gel) hay các loại pha đảo (RP) với kích thước tiểu phân thích hợp. Cột nạp các pha tĩnh RP có thể sử dụng lại nhiều lần. Việc thăm dò và lựa chọn hệ thống dung môi thích hợp cho MPLC có thể được tiến hành trên sắc ký lớp mỏng. Một hệ dung môi thích hợp cho MPLC là hệ dung môi có Rf các chất cần tách vào khoảng 0,3 trên sắc ký lớp mỏng. Với pha tĩnh RP, có thể sử dụng HPLC phân tích để thăm dò hệ dung môi.
Trên thực tế, một máy MPLC hiện đại thường có một hệ thống dung môi gồm bơm có thể thay đổi tốc độ dòng và các phụ kiện (chặn xung, gradient...); một hệ thống bơm mẫu với vòng lặp và van chuyển; cột MPLC, một detector UV, một máy tính để điều khiển thiết bị và ghi nhận kết quả; và một bộ hưng phân đoạn.
So với sắc ký cột cổ điển, hiệu năng tách của MPLC cao hơn. Hiệu năng tách của MPLC là trung gian giữa sắc ký cột cổ điển và sắc ký lỏng cao áp điều chế. So với HPLC điều chế, MPLC có thể sử dụng các cột lớn hơn nên có thể tách lượng mẫu nhiều hơn. Do các cột sắc ký là tự nhồi và chất nhồi cột là loại thông thường, dung môi không đòi hỏi chất lượng đặc biệt, thiết bị không quá phức tạp nên MPLC dễ áp dụng và kinh tế hơn so với HPLC điều chế.
5.3. Sắc ký phân bố ngược dòng
Trong sắc ký cột cổ điển và MPLC, pha tĩnh sử dụng thường là các chất hấp phụ pha thuận tương đối rẻ tiền và thường chỉ sử dụng một lần. Các pha tĩnh này thích hợp với các chất từ kém phân cực tới phân cực trung bình. Trong những trường hợp phân tích các hỗn hợp phức tạp, các chất phân cực mạnh như glycosid có mạch đường dài, các polyphenol, các alcol, acid phân tử nhỏ v.v... pha tĩnh hấp phụ thường không cho kết quả tốt. Khi ấy, người ta thường sử dụng cơ chế phân bố để tách các chất. Các pha tĩnh phân bố sử dụng trong HPLC (thường là pha đảo) rất thích hợp trong những trường hợp này. Tuy nhiên, các pha tĩnh này thường đăt tiền, chỉ sử dụng trong sắc ký điều chế khi thật cần thiết. Để cải thiện khả năng phân tách các chất phân cực, người ta phát triển phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng (Countercurent chromatography, CCC).
Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp sắc ký trong đó cả pha tĩnh và pha động ở trạng thái lỏng. Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bố ngược dòng loại trừ được những khó khăn thường gặp trong các phương pháp sắc ký trên pha tĩnh rắn như mất mẫu hay phân hủy mẫu. Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp có khả năng tách các chất phân cực hiệu quả, hệ dung môi dùng cho cả pha tĩnh và pha động linh hoạt, rẻ tiền và có thể tiến hành trên phân tích lượng mẫu khá lớn trong thời gian tương đối ngắn.
Khác với HPLC hay các kỹ thuật sắc ký cột trên pha tĩnh lỏng mà trong đó pha tĩnh thường được giữ trên một giá mang rắn, pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng là một chất lỏng theo đúng nghĩa. Hai chất lỏng hay hỗn hợp chất lỏng không đồng tan này ‘dịch chuyển’ ngược chiều và tiếp xúc liên tục với nhau. Trong quá trình dịch chuyển, các chất trong hỗn hợp mẫu cần phân tích sẽ được hòa tan một cách cạnh tranh vào pha tĩnh và pha động. Mức độ hòa tan của chất giữa 2 pha phụ thuộc vào hệ phân bố của nó tronng 2 pha. Các chất có hệ số phân bố khác nhau sẽ phân bố vào pha động và pha tĩnh với những tỉ lệ khác nhau và trong quá trình dịch chuyển của pha động sẽ dần dần tách ra khỏi nhau.
Trong quá trình pha động dịch chuyển, sự phân bố các chất giữa 2 pha diễn ra, các chất trong hỗn hợp mẫu ( đuợc đưa vào ở 1 đầu của pha tĩnh) sẽ dịch chuyển dần về cuối pha tĩnh và tách ra khỏi nhau. Các chất có hệ số phân bố trong pha động lớn sẽ tách ra trước trong pha động và đi ra khỏi hệ thống trước tiên. Chất có hệ số k càng lớn sẽ ra càng sớm. Các chất có hệ số phân bố trong pha tĩnh lớn hơn cũng được tách ra khỏi nhau và dịch chuyển trong pha tĩnh về phía cuối cột. Đến một thời điểm nào đó, khi các chất tan nhiều trong pha động đã được tách ra khỏi hệ thống, người ta ngừng không đưa pha động vào nữa mà dùng pha tĩnh để đẩy phần chất lỏng trong hệ thống ra. Các chất đã tách ra trong pha tĩnh cũng sẽ được hứng thành từng phân đoạn riêng biệt. Các chất tách trong hệ càng tôt khi “số đĩa lý thuyết” của hệ càng lớn, tức là khi sự tiếp xúc giữa 2 dung môi và chiều dài của “cột” (pha tĩnh) càng lớn.
Hệ dung môi sử dụng trong sắc ký phân bố ngược dòng thường là hỗn hợp của 2 hay nhiều (thường không quá 4)dung môi có khả năng hòa tan hạn chế vào nhau. Khi tỉ lệ các dung môi này vượt quá giới hạn hòa tan, chúng sẽ tách thành 2 pha với tỉ lệ của các dung môi trong mỗi pha hoàn toàn khác nhau. Hai pha này sẽ được sử dụng làm pha động và pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng. Ví dụ, với hỗn hợp hai dung môi là n-butanol và nước ở 300C, khi tỉ lệ hai dung môi vượt quá khả năng hòa tan vào nhau sẽ tách thành hai lớp chất lỏng riêng biệt là n-butanol bão hòa nước (với lượng nước là 7% kl/kl) và nước bão hòa n-butanol (với lượng n-butanol ~ 21% kl/kl).
Để một hỗn hợp chất lỏng có thể “đứng yên” làm pha tĩnh, người ta cần có những thiết bị đặc biệt. Thiết bị tách phân bố đơn giản nhất được sử dụng tách các hỗn hợp chất là thiết bị Phân bố ngược dòng (Countercurrent distribution – CCD) được L. C. Craig thiết kế vào những năm 1940. Thiết bị gồm nhiều bộ phận là những ống bằng thủy tinh có thiết kế đặc biệt để chứa pha tĩnh và pha động, khi vận hành có thể chuyển pha động từ ống này sang ống khác. Mỗi ống chiết đuợc xem như một đĩa lý thuyết. Nhược điểm của thiết bị này là số đĩa không nhiều nên khả năng tách tương đối hạn chế và thiết bị tương đối cồng kềnh. Ngày nay, có một số thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng với số đĩa lý thuyết lớn hơn, gọn và dễ sử dụng hơn đang được sử dụng trong các phòng thí nghiệm.
Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ (Droplet countercurrent chromatography – DCCC) được Yoichiro Ito và cộng sự giới thiệu vào những năm 1970. DCCC sử dụng những ống nhỏ có đường kính trong 2 -4 mm và chiều dài 40cm. Các ống này (khoảng 300 ống) được xếp đứng song song với nhau và nối với nhau qua hệ thống ống teflon với đầu ống này nối vào cuối ống kia. Pha động được dịch chuyển qua pha tĩnh dưới dạng những hạt nhỏ nổi lên hay chìm xuống trong pha tĩnh (tùy thuộc vào pha động nặng hơn hay nhẹ hơn pha tĩnh). Nhược điểm của DCCC là tốc độ chậm và hiệu quả tách chưa cao do sự tiếp xúa kém giữa 2 pha.
Sắc ký phân bố ly tâm (Centrifugal partition chromatography –CPC) hay còn gọi là Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ ly tâm (Centrifugal droplet countercurrent chromatography – CDCCC) cũng tương tự như DCCC nhưng dòng pha động có thể được bơm vào với tốc độ cao hơn ( có thể tới 100 lần so với DCCC) nhờ tác động của lực ly tâm. Thiết bị gồm các ống polymer chịu dung môi (như teflon) nối với nhau giống như DCCC nhưng được sắp xếp theo hướng từ tâm ra ngoài của 1 trục quay. Khi vận hành, các ống được quay quanh trục và lực ly tâm sẽ giữ chop ha tĩnh trong ống. Pha tĩnh được bơm vào hệ thống theo hướng từ tâm ra ngoài với pha động nặng hơn hay ngược lại với pha tĩnh nhẹ hơn. Do khả năng tiếp xúc giữa 2 dung môi tốt hơn nên CDCCC có số đĩa lý thuyết lớn hơn. Tốc độ phân tách của CPC cũng nhanh hơn so với DCCC.
Hệ thống sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (High speed countercurrent chromatography – HSCCC) là hệ thống được Y. Ito phát triển vào những năm 1980 và được sử dụng nhiều hiện nay trong các thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng do hiệu quả phân bố cao và tốc độ phân tách nhanh. Cũng giống như DCCC, HSCCC sử dụng lực ly tâm để giữ một chất lỏng trong hệ thống làm pha tĩnh và chất lỏng còn lại được bơm vào hệ thống làm pha động. Thiết bị HSCCC bao gồm 1 ống nhựa teflon với 1 đầu của ống được dùng làm đầu vào còn đầu kia là đầu ra của hệ thống. Đầu vào và đầu ra của hệ thống có thể đảo ngược tùy theo pha động là nặng hay nhẹ hơn so với pha tĩnh. Ống này được cuộn xoắn lại theo kiểu lò xo hay xoắn ốc, vừa có thể quay quanh trục của nó đồng thời được sắp xếp để có thể quay quanh 1 trục chung theo kiểu chuyển động của hành tinh quanh mặt trời. Tùy theo thiết kế mà thiết bị có số lượng cuộn và cách sắp đặt các cuộn có khác nhau. Trong đó, loại thiết bị có cách sắp xếp các cuộn xoắn theo ‘kiểu J’ phổ biến và được sử dụng nhiều nhất.
Trong phân lập các chất trong dược liệu, để việc phân lập hiệu quả hơn, đặc biệt là với các hỗn hợp phức tạp và có cấu trúc gần giống nhau, người ta thường sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký với các cơ chế tách khác nhau. Ví dụ, như phân tách cao chiết thành các phân đoạn đơn giản hơn bằng các phương pháp sắc ký cột cải tiến (FC, VLC) sau đó tách bằng sắc ký cột cổ điển với các loại pha tĩnh khác nhau, sắc ký rây phân tử, MPLC và HPLC điều chế. Việc áp dụng các phương pháp nên đi dần từ đơn giản đến phức tạp, từ các phương tiện, pha tĩnh rẻ tiền tới các loại có giá thành cao.
No comments:
Post a Comment