PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

 

Sắc ký là một phương pháp phân tách lý - hóa trong đó các chất được tách ra khỏi hỗn hợp dựa trên sự “phân bố” liên tục của chúng giữa 2 pha, một pha không chuyển động (pha tĩnh) và một pha chuyển động (pha động) dịch chuyển qua pha tĩnh theo một phương nhất định.

Trong các phương pháp phân tách hiện nay, sắc ký là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi một hỗn hợp, ngay cả những hỗn hợp phức tạp về thành phần và khác nhau về hàm lượng trọng hỗn hợp như dịch chiết từ các hợp chất từ cây cỏ. Từ khi phương pháp sắc ký ra đời (1903) cho tới nay rất nhiều kỹ thuật sắc ký cũng như các cải tiến về pha tĩnh, thiết bị và phương pháp phát hiện đã được phát triển và áp dụng trong thực tế để phân tích định tính, định lượng và chiết tách các chất, đặc biệt là thành phần hóa học của cây cỏ.

Theo như định nghĩa, các yếu tố quan trọng nhất trong hệ thống sắc ký quyết định đến khả năng tách một hỗn hợp mẫu xác định nào đó là pha tĩnh và pha động.

Với pha tĩnh, cơ chế phân tách là một trong những yếu tố quan trọng nhất. Các pha tĩnh đang được sử dụng trong sắc ký hiện nay dựa trên cơ chế phân tách khác nhau: phân bố, hấp thu, rây phân tử, trao đổi ion, điện di, ái lực... Trong đó, cơ chế phân bố và hấp thu là 2 cơ chế được sử dụng chủ yếu hiện nay.

Khả năng phân tách của pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào mức độ tiếp xúc của pha tĩnh với mẫu thử và pha động. Yếu tố này liên quan đến diện tích bề mặt riêng và mật độ pha tĩnh. Diện tích bề mặt riêng càng lớn (kích thước tiểu phân của pha tĩnh càng nhỏ) thì khả năng phân tách của pha tĩnh càng lớn. Mật độ pha tĩnh cao, khả năng tạo cân bằng pha càng lớn, hệ càng phân tách tốt.

Pha tĩnh thông dụng nhất dùng trong sắc ký hấp phụ hiện nay là Silica gel. Nhôm oxyd và các chất hập phụ khác cũng được dùng nhưng ở mức độ thấp hơn rất nhiều. Sắc ký pha thuận thường dùng trong sắc ký lớp mỏng và trong các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển hay cải tiến.

Với cơ chế phân bố, pha tĩnh có thể là (a) các chất lỏng thực sự, hay (b) 1 lớp chất lỏng tẩm hay phủ lên bề mặt của một giá mang rắn, hoặc (c) được gắn vào giá mang rắn bằng liên kết hóa học (pha liên kết – boned phase). (a) thường là pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng; (b) thường gặp trong pha tĩnh sắc ký khí và sắc ký giấy và (c) là loại phổ biến nhất hiện nay, thường dùng trong sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lỏng quá tới hạn. Chất lỏng được sử dụng làm pha tĩnh có thể là chất phân cực (phân bố pha thuận) hay không phân cực (phân bố pha đảo). Phần lớn các phân tích HPLC hiện nay sử dụng pha đảo RP-18 với pha tĩnh là mạch hydrocarbon có 18 carbon gắn vào giá mang là Silica gel.

Với pha động, bản chất của pha động có ảnh hưởng quan trọng nhất tới quá trình phân tách của hệ sắc ký. Pha động thường là một hệdung môi gồm có hai (hay nhiều hơn) dung môi phối hợp với nhau theo những tỷ lệ thích hợp. Một  pha động tốt là pha động có khả năng phân tách tốt các chất nhưng không quá phức tạp về thành phần hay tỷ lệ, rẻ tiền, không độc hai và thân thiện với môi trường. Thành phần và tỉ lệ dung môi trong pha động có thể không đổi trong suốt quá trình phân tích sắc ký (như trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy hay sắc ký lỏng cao áp đẳng dung môi – isocratic) hay thay đổi theo hướng tăng dần độ mạnh của hệ dung môi (rửa giải theo gradient như trong sắc ký cột các loại). Một yếu tố quan trọng khác là tốc độ của dòng pha động. Tốc độ dòng phải được tối ưu hóa để đạt được cân bằng pha với số đĩa lý thuyết của hệ thống là lớn nhất nhưng không làm tăng hiện tượng giãn rộng các băng các chất được tách ra khỏi hỗn hợp. Với sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng hy sắc ký cột cổ điển, chỉ cần lực mao dẫn hay áp suất thủy tĩnh là đủ tạo nên dòng dung môi cho phân tích, trong khi sắc ký lỏng áp suất trung bình và đặc biệt là sắc ký lỏng cao áp cần có 1 áp lực cao nhất định mới có thể có được tốc độ dòng tối ưu.

Để phát hiện các chất tách ra trong hệ thống sắc ký người ta có thể quan sát các vết tách ra dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại hay sủ dụng các thuốc thử hiện màu (như trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy) hay phát hiện các chất bằng đặc tính vật lý của chúng (chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện, dẫn nhiệt, phổ UV – Vis, IR, MS, NMR...) bằng các thiết bị phát hiện (detector) như trong các phương pháp sắc ký cột, sắc ký khí, sắc khí lỏng cao áp... Độ nhạy của phương pháp phát hiện (các detector) cũng được cải tiến để có thể phát hiện các chất có hàm lượng ngày càng thấp hơn (ng, pg, fg).

Với các thiết bị hiện đại, khả năng tách và độ nhạy của phương pháp sắc ký ngày càng cao, lượng mẫu cần để phân tích ngày càng nhỏ trong khi kích thước các tiểu phân pha tĩnh và kích thước cột ngày càng nhỏ và áp suất của dòng pha động ngày càng cao.

Có nhiều cách phân loại và gọi tên các phương pháp sắc ký. Ví dụ:

-    Theo cơ chế của quá trình phân tách, ta có: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ (rây phân tử, lọc gel hay thấm gel), sắc ký ái lực và điện di.

-    Theo pha động, người ta phân thành: sắc ký lỏng (liquid chromatography, LC), sắc ký khí (gas chromatography, GC), sắc ký lỏng quá tới hạn (super – critical fluid chromatograyphy, SFC).

-    Theo hình dạng của pha tĩnh người ta xếp các phương pháp sắc ký vào 2 nhóm chính là sắc ký trên mặt phẳng (palar chromatography, PC) trong đó có các kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng... và sắc ký cột (columm chromatography, CC) trong đó có các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí...

-    Theo áp lực đẩy dòng dung môi đi qua pha tĩnh, ta có: Sắc ký lỏng áp suất thấp (low pressure liquid chromatography, LPLC) bao gồm các sắc ký cột cổ điển hay cải tiến, sắc ký lỏng áp suất trung bình (medium pressure liquid chromatography, MPLC) và sắc ký lỏng áp suất cao (high pressure liquid chromatography, HPLC, sắc ký lỏng cao áp)...

-    Theo phương pháp khai triển sắc ký, người ta phân ra phương pháp phân tích tuyến, phương pháp thế chỗ và phân tích rửa giải.

-    Trên thực tế, người ta thương gọi tên các phương pháp sắc ký theo thói quen chứ không gọi theo một cách thống nhất.

Trong nghiên cứu dược liệu, sắc ký thường được sử dụng cho các công việc sau:

Định tính

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của phương pháp sắc ký trong dược liệu họ là định tính thành phần các chất trong dược liệu, trong dịch chiết dược liệu hay phát hiện các tạp chất, các chất giả mạo pha trộn trong dược liệu hay các thành phẩm từ dược liệu. Khi sử dụng các phổ kế làm detector, chúng cung cấp một phương tiện rất hiệu quả cho định tính các chất trong một hỗn hợp.

Có thể sử dụng phương pháp sắc ký để phát hiện các thành phần trong hỗn hợp với số lượng, R_f  hay R_t, màu sắc hay đặc điểm phổ biến của các chất. Khi sử dụng các chất chuẩn sắc ký trong cùng điều kiện, người ta có thể xác nhận sự có mặt của một chất nào đó trong dược liệu mà không cần phải phân lập chất đó. Điều này giúp cho việc xác nhận dược liệu, tránh nhầm lẫn vì mỗi dược liệu có thành phần hóa học nhất định, đặc trưng cho nó. Ví dụ, hoa Hòe có rutin, Trúc đào có neriolin, Mã tiền có strychnin v.v...

Các phương pháp sắc ký còn được sử dụng trong định tính điểm chỉ (dấu vân tay) các dược liệu. Với định tính điểm chỉ, thay cho chất chuẩn, người ta sử dụng một dược liệu chuẩn và tiến hành chiết xuất, sắc ký trong cùng một điều kiện với dược liệu cần kiểm nghiệm. Sự khác biệt giữa sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử cho phép đánh giá chất lượng dược liệu. Các thành phần lạ trên mẫu thử không có ở mẫu chuẩn có thể là dấu hiệu cho thấy dược liệu không đúng, bị pha tạp hay kém chất lượng.

Về nguyên tắc, hai mẫu dược liệu của cùng một loài phải có sắc ký đồ đồng nhất. Từ đó, có thể xác nhận được mẫu kiểm nghiệm có đúng hay không, có bị giả mạo hay pha tạp hay không. Trên thực tế, thành phần các chất trong các mẫu có thể có những sai biệt nhất định do các điều kiện di truyền (các chủng, dạng, thứ hay loài phụ, các loài lai, loài trồng trọt...) hay điều kiện phát triển (thổ nhưỡng, khí hậu), điều kiện thu hái (tuổi, mùa thu hái) v.v... Tùy thuộc vào từng loài, và yêu cầu sử dụng mà có thể chấp nhận những sự khác biệt về thành phần đến một mức độ nào đó. Nếu sự khác biệt quá lớn, đặc biệt là trên những thành phần chính, thường là do các biến thể dưới loài hay cây mọc ở các vùng có điều kiện rất cách biệt nhau thì có thể phải coi là những dược liệu riêng biệt. Định tính điểm chỉ hiện đang được sử dụng nhiều trong thực tế để kiểm nghiệm dược liệu và các thuốc có nguồn gốc tự nhiên để phát hiện giả mạo hay bị pha trộn các dược liệu khác. Nhiều chuyên luận của Dược điển Việt Nam IV có quy định sử dụng định tính điểm chỉ.

Định lượng

Các phương pháp sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng các chất thông dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại. Khác với các phép định lượng hóa học, các phương pháp sắc ký cho phép định lượng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, với điều kiện là phải có chất chuẩn tương ứng. Người ta có thể định lượng một chất hay định lượng đồng thời nhiều chất trong 1 lần định lượng nếu chọn được điều kiện thích hợp. Sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí, điện di mao quản là những phương pháp thông dụng nhất vì khả năng phân tách cao, độ nhạy và độ lặp cao. Sắc ký lớp mỏng kết hợp với mật độ quang kế hiện chỉ còn được coi là phương pháp bán định lượng.

Theo dõi thành phần các chất

Các phương pháp sắc ký là có thể dùng nhu là phương pháp theo dõi, đánh giá sự thay đổi thành phần (và hàm lượng) các chất trong cây thuốc trong trồng trọt, trong dược liệu trong quá trình bảo quản hay trong dịch chiết trong quá trình chiết xuất và phân tích các chất.

Phân lập các chất

Một ứng dụng khác nữa của các phương pháp sắc ký là phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu. Các chất tinh khiết phân lập được có thể được dùng trong xác định cấu trúc, chất chuẩn cho định tính, định lượng, nghiên cứu các đặc tính dược lý hay độc tính và sử dụng làm thuốc (khi chiết xuất, phân lập ở quy mô lớn). Các phương pháp sắc ký phân lập các chất được trình bày ở phần chiết xuất và phân lập các chất.

Dưới đây là một vài phương pháp sắc ký thông dụnh nhất áp dụng cho phân tích các chất từ dược liệu.

1. Sắc ký giấy

Cơ chế phân tách của sắc ký giấy chủ yếu là phân bố, trong đó pha tĩnh (thường là nước) được thấm trên một tờ giấy thấm đặc biệt gọi là giấy sắc ký. Nhờ các xoang rỗng trong sợi cellulose của tờ giấy sắc ký khác nhau, phân biệt theo độ thấm dung môi và mức độ dày mỏng của giấy, với các mã hiệu tùy thuộc vào hãng sản xuất. Khi tiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp.

Có 2 phương pháp triển khai sắc ký phẳng là sắc ký đi lên và sắc ký đi xuống tùy thuộc vào chiều đi của pha động. Tỷ lệ giữa khoảng cách đường đi của chất phân tích với đường đi của pha động tính từ điểm đặt chất phân tích gọi là R­_f. Tỉ lệ giữa đường đi của chất phân tích với đường đi của một chất đối chiếu được gọi là R_r, so với R_f, giá trị R_r ổn định hơn nên dễ so sánh hơn. Các trị số R_f  và R_r  của  nhiều hoạt chất quen thuộc trong ­dược liệu kèm theo hệ dung môi triển khai thường được ghi sẵn trong các tài liệu để tra cứu đối chiếu.

Kết quả sắc ký thu được với các vết của các chất phân tích được phân bố trên giấy sắc ký được gọi là sắc đồ. Các chất được tách ra trên sắc đồ được phát hiện và đánh giá bằng màu sắc, kích thước, hình dạng các vết hiện ra sau khi quan sát ở ánh sáng thường hoặc ánh sáng đèn tử ngoại trước và/hoặc sau khi phun ra các thuốc thử hiện màu. Để có kết luận một chất nào đó khi đối chiếu chất phân tích với chất chuẩn thường phải tiến hành trên 3 hệ dung môi khác biệt.

Trong nhiều trường hợp, để kết quả phân tách tốt hơn, người ta cần phải tiến hành sắc ký hai chiều. Muốn vậy, trên một tờ giấy vuông (60 x 60cm hoặc 40 x 40cm) người ta chấm dung dịch cần phân tích ở góc cáhc mép tờ giấy 4 – 6cm. Sau khi triển khai lần thứ nhất với một hệ dung môi thì chuyển tờ giấy đó sang một buồng sắc ký thứ hai, quay tờ giấy một góc 90^o và triển khai lần hai với dung môi thứ hai. Sau khi hiện màu, các vết sẽ phân bố trên mặt phẳng chứ không phải trên một đường thẳng.

Sắc ký giấy là 1 phương pháp sắc ký phân bố pha thuận, áp dụng tốt cho các chất phân cực từ trung bình tới mạnh như các glycosid, các hợp chất polyphenol, các acid hữu cơ phân tử nhỏ, acid amin, các monosaccharid và oligosaccharid…Ngoài việc phân tích thành phần của hỗn hợp, sắc ký giấy cũng có thể dùng để diều chế một lượng nhỏ các chất bằng cách chấm mẫu thử thành các băng. Sau khi triển khai, cắt các băng chất được tách ra rồi phản hấp phụ bằng dung môi thích hợp. Lặp lại nhiều lần thì có thể thu được lượng chất tinh khiết cần thiết.

Do khả năng phân tách hạn chế, việc thực hiện tốn nhiều thời gian nên hiện nay phương pháp này có tính ứng dụng hạn chế và được thay thế bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng pha đảo hay sắc ký lỏng cao áp.

2. Sắc ký lớp mỏng

Trong sắc ký lớp mỏng, pha tĩnh được trải trên 1 mặt phẳng với một đọ dày thích hợp tử 0,1 mm đến 0,2 mm và dung môi dịch chuyển qua pha tĩnh chủ yếu bằng lực mao dẫn. Pha tĩnh thông dụng nhất trong sắc ký lớp mỏng là Silica gel với cơ chế phân tách chính là hấp phụ. Tuy nhiên, cơ chế phân tách trong sắc ký lớp mỏng cũng có thể là sắc ký phân bố hoặc kết hợp cả hai, hoặc các cơ chế khác, tùy thuộc vào pha tĩnh và dung môi sử dụng. Các chất khác sử dụng làm pha tĩnh có thể là nhôm oxyd, Kieselguhr, cellulose, polyamid hay các loại Silica gel pha đảo.

Để chuẩn bị bản sắc ký phân tích, người ta trải một lớp mỏng có chiều dày 0,2 – 0,3 mm thật đều bằng tay hay bằng dụng cụ tráng sắc ký trên một tấm kính. Với bản sắc ký chế hóa, bề dày lớp tráng có thể tới 2 mm. Các chất dùng để tráng có thể là bột mịn Silica gel hoặc nhôm oxyd, Kieselguhr… Bột có thể không có thêm chất dính (dùng để tráng khô) hoặc có thể thêm chất dính (ví dụ, silicagel có trộn thêm CaSO₄) và thêm nước để tạo thành hỗn dịch (tráng ướt). Sau khi tráng ướt, bảng mỏng được để ráo và sấy hoạt hóa trước khi sử dụng. Hiện nay, có nhiều hãng sản xuất các bản sắc ký tráng sẵn trên tấm kính, nhôm hoặc nhựa, ví dụ hãng Merck của Đức, hãng Eastman, Kodak của Mỹ. Kích thước bản sắc ký có thể thay đổi tùy mục đích sử dụng, nhưng không quá 20 x 20 cm. Ngoài việc nâng cao chất lượng pha tĩnh, các hãng sản xuất có thể có những cải tiến nhất định các bản tráng sẵn để cải thiện việc phân tách như bản sắc ký vùng đậm đặc để cải thiện việc đưa mẫu lên bản mỏng.

Với sắc ký lớp mỏng, đặc biệt là sắc ký hấp phụ, có thể sử dụng nhiều hệ dung môi khác nhau. Có thể sử dụng các dung môi với độ phân cực tăng dần (xem bảng). Muốn có dung môi với giá trị trung gian không có trong bảng trên, ta dùng hỗn hợp pha với hai dung môi theo tỉ lệ thích hợp.

Có nhiều phương thức triển khai sắc ký lớp mỏng khác nhau (như dưới lên, trên xuống, nằm ngang) trong các kiểu bình sắc ký khác nhau như trong bình đứng thông thường (bình N), bình nằm ngang hay ‘bình’ hẹp đặc biệt (bình S). Tuy nhiên, thông dụng nhất vẫn là triển khai dung môi từ dưới lên trong bình sắc ký bởi tính đơn giản và dễ sử dụng của nó. Cũng như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng hai chiều (trên bản có kích thước tối đa 20 x 20 cm) cũng được sử dụng.

Hằng số điện môi của một số dung môi sắc ký thông dụng

Dung môi	εo	Dung môi	εo
Ether dầu	0,01	Dichlor ethan	0,49
Hexan	0,01	Aceton	0,56
Heptan	0,01	Dioxan	0,56
Cyclo hexan	0,04	Butanol	0,56
Carbon tetrachlorid	0,18	Ethyl acetat	0,58
Ether isopropylic	0,28	Acetonitril	0,65
Toluen	0,29	Pyridin	0,71
Benzen	0,32	Dimethylsulfoxid	0,75
Ether ethylic	0,38	Alcol isopropylic	0,82
Chloroform	0,40	Alcol ethylic	0,88
Methylen chlorid	0,42	Alcol methylic	0,95

So với sắc ký giấy, thời gian triển khai đối với sắc ký lớp mỏng nhanh hơn, lượng mẫu phân tích cần ít hơn, khả năng phân tách cũng tốt hơn. Ngoài ra, có thể sử dụng các thuốc thử mạnh như acid sulfuric, nitric đậm đặc… để phát hiện các vết. Vì thế, sắc ký lớp mỏng là phương pháp được sử dụng chủ yếu hiện nay để phát hiện, theo dõi các chất trong hỗn hợp khi yêu cầu phân tích không đòi hỏi các phương pháp hiện đại hơn.

Một trong những cải tiến của sắc ký lớp mỏng là người ta giảm kích thước của hạt silica gel để tăng diện tích bề mặt riêng làm hiệu năng phân tách của pha tĩnh. Kích thước hạt Silica gel trung bình là 6 μm so với sắc ký lớp mỏng thông thường la 15 μm. Khi đó quãng đường và thời gian sắc ký có thể rút ngắn còn ½ so với sắc ký lớp mỏng thông thường mà vẫn có kết quả tách tương tự hay thậm  chí tốt hơn. Các bản sắc ký như vậy được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao(High performance TLC, HPTLC). Kích thước bản HPTLC thường là 5 hay 10 cm.

Đối với sắc ký lớp mỏng, diện tích và mật độ của một vết tách ra trên sắc đồ trong các điều kiện xác định thì tỷ lệ với lượng chất có trong vết đó. Vì thế, người ta có thể định lượng các chất trong hỗn hợp bằng phép đo mật độ quang so sánh với giai mẫu chuẩn được triển khai trên cùng bản sắc ký. Người ta cũng có thể cạo vùng pha tĩnh ứng với từng vết rồi giải hấp hoạt chất chứa trong đó bằng dung môi thích hợp, sau đó định lượng bằng các phương pháp thích hợp như đo huỳnh quang, đo màu hay đo độ hấp thư tử ngoại.

Để tách các hạt chất từ một hỗn hợp, người ta có thể dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (chế hóa) hay còn gọi là sắc ký lớp dày. Để có thể đưa nhiều mẫu hơn lên bản mỏng, bề dày lớp chất hấp phụ có thể là 0,5 – 1 mm, có thể tới 2 mm. Mẫu được đưa lên bản mỏng dưới dạng vệt dài (băng). Sau khi triển khai, định vị các băng chất tách ra bằng cách thích hợp và cạo lấy băng chất cần lấy. Phải hấp phụ bằng dung môi để thu lấy chất tinh khiết. Lặp lại trên vài bản sắc ký thì có thể thu được lượng mẫu cần thiết cho việc xác định cấu trúc.

Trong phân tích dược liệu, sắc ký lớp mỏng là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất bởi khả năng phân tách tốt, linh động, dễ thực hiện và kinh tế của nó. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng trong phân tích thành phần của các dược liệu, định tính các chất trong dược liệu, cao chiết bằng so sánh với chất chuẩn, định tính dược liệu bằng điểm chỉ, theo dõi quá trình chiết xuất, thăm dò các điều kiện phân tích cho sắc ký cột…

Khả năng phân tích của sắc ký lớp mỏng cũng rất đa dạng, từ những chất kém phân cực tới các chất phân cực trung bình tới mạnh. Rất nhiều các nhóm hợp chất tự nhiên có giá trị trong trị liệu có thể phân tích bằng sắc ký lớp mỏng. Tuy khả năng phân tách không cao và không nhạy bằng HPLC hay GC nhưng sắc ký lớp mỏng hiện vẫn là phương pháp rất phổ biến và hữu ích trong phân tích dược liệu. Dược điển nhiều nước (Anh, Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam…) vẫn sử dụng rộng rãi phương pháp sắc ký lớp mỏng trong kiểm nghiệm dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu. Có nhiều bài báo và tài liệu xuất bản về sắc ký lớp mỏng áp dụng trong kiểm nghiệm dược liệu, đặc biệt là để định tính điểm chỉ dược liệu. Trong đó, cuốn “Plant Drug Analysis – A Thin Layer Chromatography Atlas” của Wagner H. và Bladt S. (Bản tiếng Anh do nhà xuất bản Springer Verlag ấn hành năm 1996) được xem là có giá trị nhất hiện nay.

3. Sắc ký lỏng cao áp

Trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC), để tăng hiệu năng tách của cột sắc ký, người ta sử dụng chất nhồi cột với kích thước rất nhỏ, thường dưới 10 μm với đường kính của các xoang xốp bên trong các hạt từ 80 – 120 Å cho phân tích các phân tử  nhỏ và 300 Å dùng cho phân tích các đại phân tử. Do kích thước hạt rất nhỏ, để dung môi có thể chảy qua với tốc độ dòng tối ưu (khoảng 1ml/phút với cột có đường kính trong 4,6 mm được nhồi pha tĩnh có kích thước 3,7 μm), người ta phải dùng bơm nén với áp suất cao (có thể tới 400 atm) để đẩy dòng dung môi qua cột. Vì thế nên phương pháp được gọi là sắc ký lỏng cao áp.

Các loại cột HPLC phân tích thông dụng hiện nay sử dụng các hạt nhồi có kích thước 3,7 μm. Gần đây, các hạt nhồi có kích thước hạt 1,7 μm đã được sử dụng.

Cột sắc ký loại này có hiệu năng tách cao hơn so với loại cột chứa hạt nhồi 3,7 μm nhưng cũng phải dùng áp suất cao hơn rất nhiều (tới 1000 atm) để bơm dung môi. Các máy sắc ký sử dụng áp suất cao này được gọi là sắc ký lỏng siêu cao áp (ultra high pressure liquid chromatography, UHPLC, hay còn được gọi là sắc ký lỏng siêu hiệu năng, Ultra (high) performance liquid chromatography, U(H)PLC)¹. Khi áp lực bơm tăng lên cao sẽ ảnh hưởng tới cấu trúc pha tĩnh cũng như các vấn đề về thiết bị. Người ta cũng cải tiến hình dạng và bề mặt pha tĩnh để giảm bớt áp suất bơm dung môi. Một số cột có các pha tĩnh như vậy cũng đã có trên thị trường như cột đơn khối (monolithic) hay các hạt có cấu trúc xốp ở bề mặt nhưng đặc ở tâm… hoặc được tăng cường thêm lực chịu nén của các hạt pha tĩnh.

Các loại cột dùng cho sắc ký điều chế các chất có thể sử dụng các hạt nhồi có kích thước hạt tương tự như cột phân tích, nhưng thường được nhồi với các hạt có kích thước hơi lớn hơn (5 μm) để làm giảm áp suất bơm dung môi.

Kích thước cột sắc ký phân tích cũng thay đổi theo hiệu năng tách và nhu cầu phân tích. Đường kính trong của cột phân tích thay đổi từ 0,05 – 5 mm, thông dụng hiện nay là 4,6 mm; 3,0 mm hay 2,1 mm. Các cột dùng với mục đích điều chế có đường kính trong lớn hơn từ 7 mm với cột bán điều chế tới 100 mm hay hơn. Chiều dài cột thay đổi từ 30 -300 mm.

Pha tĩnh sử dụng trong HPLC rất phong phú và đa dạng. Các cơ chế tách như phân bố, hấp phụ, rây phân tử, trao đổi ion… đều được sử dụng. Tuy nhiên, các pha tĩnh thông dụng nhất là pha tĩnh phân bố (pha đảo hay pha thuận). Các hạt nhồi của loại pha tĩnh này thường có một nhân (giá mang) là Silica gel với các nhóm OH silanol trên bề mặt được liên kết với một chất khác đóng vai trò là pha tĩnh thực sự. Loại hạt nhồi này thường được gọi là pha liên kết (bonded phase). Thông dụng nhất là các loại pha tĩnh RP – 18, RP – 8 với pha tĩnh tương ứng là một mạch hydrocarbon có 18 hay 8 carbon. Các pha tĩnh khác ít được sử dụng hơn.

Dung môi (pha động) dùng trong HPLC (pha đảo) thông dụng nhất là hỗn hợp nước – methanol hoặc nước – acetonitril với các tỉ lệ khác nhau. Để tăng khả năng phân giải các chất có khả năng phân ly, các dung dịch đệm với pH khác nhau hay các acid (acid trifluoroacetic, acetic, formic) hay các chất kềm hữu cơ có thể được thêm vào pha động. Với các pha tĩnh sắc ký khác, đặc biệt là sắc ký hấp phụ, có thể sử dụng nhiều hệ dung môi khác nhau.

Detector

Có khá nhiều loại detector được sử dụng trong việc phát hiện các chất tách ra khỏi cột sắc ký lỏng cao áp. Các detector phát hiện sự thay đổi các đặc tính của dung dịch rửa giải như detector chỉ số khúc xạ (reflective index, RI), detector điện hóa (electrochemical detector), detector tán xạ bay hơi (evaporating light scattering detector, ELSD), detector UV-Vis đơn bước song (UV detector) hay detector huỳnh quang (fluorescence detector) cho biết có các chất ra khỏi cột vào những thời điểm nhất định. Các detector quang phổ như detector dãy diod quang (photodiode array, PDA), khối phổ (MS) hay cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ngoài việc cho biết các chất ra khỏi cột thời gian trên sắc ký đồ truyền thống còn cho biết thêm nhưng thông tin quan trọng khác về chất được tách ra, đó là phổ của các chất. Các thông tin này rất có ích và tăng độ tin cậy của việc nhận định các chất, so sánh với chất chuẩn. Phần lớn các detector sử dụng trong HPLC không phá hủy các chất (ngoại trừ MS). Các hệ thống sắc ký hiện đại có thể ghép nối tiếp hay song song nhiều detector với nhau để có thêm thông tin xác định các chất.

Ứng dụng trong phân tích dược liệu

Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng. Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng cao áp là có thể phân tích được rất nhiều loại hợp chất khác nhau. Tuy hiệu năng tách của sắc ký lỏng cao áp không cao bằng sắc ký khí nhưng khả năng phân tích của nó rộng hơn nhiều. Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hơn các phương pháp khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú. Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao áp hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất.

Sắc ký lỏng cao áp thường được sử dụng nhất trong định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu khi so sánh diện tích đỉnh với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích. Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, sắc ký cao ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt.

Sắc ký lỏng cao áp hiện nay cũng đang được quan tâm trong phân tích điểm chỉ các chất trong hỗn hợp. Với sắc ký điểm chỉ, người ta có thể xác định nguốn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt dược liệu với các loài tương cận, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu… So với sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao áp có hiệu năng tách cao hơn nên cho các kết quả điểm chỉ chi tiết và nhiều giá trị hơn. Khi kết hợp với các thiết bị quang phổ hiện đại, sắc ký lỏng cao áp cung cấp nhiều thông tin giá trị trong việc xác định các chất. Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối LC-MS-NMR-CD để phân tích thành phần các dịch chiết và xác định cấu trúc các chất trong hỗn hợp mà không cần tách riêng các chất.

Một ứng dụng khác của sắc ký lỏng cao áp là phân lập các chất tinh khiết (HPLC điều chế). Về nguyên tắc, sắc ký lỏng cao áp điều chế chia sẻ mọi nguyên lý của HPLC phân tích. Điểm khác biệt duy nhất là hệ thống sử dụng cột sắc ký lớn hơn, với lượng pha tĩnh nhiều hơn để có thể phân tích được nhiều mẫu hơn và các chất tách ra khỏi cột được thu lại để có được các chất tinh khiết. Theo truyền thống, các cột có đường kính trong lớn hơn 4,7mm có thể được xem là cột bán điều chế. Các cột chế điều chế quy mô phòng thí nghiệm có kích thước thay đổi từ 1 – 10 cm. Trong quy mô công nghiệp, các cột sắc ký lỏng cao áp điều chế có thể có đường kính trong tới 100 cm. So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp có chi phí cao hơn nên thường chỉ sử dụng trong các trường hợp không tác được bằng các phương pháp sắc ký cột thông thường hay MPLC.

4. Sắc ký khí

Sắc ký khí là phương pháp sắc ký mà pha động lỏng được thay bằng một dòng khí liên tục chạy qua pha tĩnh. Các chất được tách ra khỏi hỗn hợp bởi tương tác khác nhau của chúng với pha tĩnh. Do khả năng hòa tan rất kém của chất khí, dòng khí này không đóng vai trò của một pha động thực sự trong hệ thống sắc ký. Nó chỉ làm nhiệm vụ lôi cuốn các chất trong pha hơi chạy dọc theo pha tĩnh để chúng có thể tương tác với pha tĩnh. Vì thế, dòng khí chạy trong cột sắc ký khí chỉ được gọi là khí mang. Đóng vai trò đẩy các chất ra khỏi pha tĩnh trong sác ký khí chính là nhiệt độ. Các chất có nhiệt độ sôi khác nhau sẽ bị lưu giữ hay bị lôi cuốn bởi dòng khí mang khác nhau. Từ đó các chất tách ra khỏi nhau. Do phải được hóa hơi để có thể được lôi cuốn đi bởi dòng khí mang, chỉ những chất bay hơi mới có thể được phân tách. Vì vậy, sắc ký khí chỉ áp dụng được cho các chất có khả năng bay hơi ở nhiệt độ tiến hành sắc ký.

Cấu tạo của một hệ thống sắc ký khí hiện đại bao gồm những thành phần chính sau: (a) Khí mang và hệ thống điều chỉnh khí, (b) cổng bơm mẫu và thiết bị bơm mẫu, (c) cột sắc ký, (d) buồng cột, (e) detector và (f) máy tính dùng để điều khiển thiết bị, ghi nhận và lưu trữ kết quả.

4.1. Khí mang và hệ thống điều chỉnh khí

Các khí mang thông dụng nhất là nitơ và heli. Nitơ rẻ tiền và sẵn có hơn so với heli. Heli cho hiệu quả tách thường cao hơn. Khí mang phải không được có các khí lạ khác ảnh hưởng tới phân tích như tương tác với các chất phân tích, với pha tĩnh hay tạo nên các peak lạ trong sắc ký đồ. Độ tinh khiết của các khí thông thường phải cao hơn 99,95%. Các chất không được phép có trong khí mang là oxy, khí carbonic, hơi nước và các halogen. Chúng phải được lọc trước khi đưa vào hệ thống sắc ký bởi hệ thống lọc.

Để có được tốc độ dòng tối ưu, một hệ thống đo và điều chỉnh áp suất, lưu lượng khí được sử dụng. Hệ thống này cho phép điều chỉnh lưu lượng/áp suất dòng khí vào cột một cách chính xác theo yêu cầu phân tích.

4.2. Cổng bơm mẫu và thiết bị bơm mẫu

Là nơi mẫu dưới dạng lỏng được bơm vào hệ thống. Cổng bơm mẫu được gia nhiệt để cho tất cả các thành phần trong mẫu lỏng được hóa hơi và đi vào hệ thống. Với sác ký khí mao quản, lượng mẫu thường không vượt quá 10 ml. Với sắc ký khí cột nhồi, lượng mẫu bơm có thể lớn hơn. Toàn bộ lượng mẫu bơm vào sau khi được hóa hơi có thể đi vào cột sắc ký (bơm mẫu không chia dòng) hay chỉ một lượng nhất định hơi đi vào cột phân tích, phần còn lại được đẩy ra ngoài (bơm mẫu chia dòng).

Có thể bơm mẫu vào cổng bơm mẫu bằng tay với một xylanh. Người ta cũng có thể tự động hóa bằng một bộ phận bơm mẫu tự động. Trong kỹ thuật head space, mẫu được hóa hơi trong một chai đựng mẫu kín rồi được bơm vào hệ thống sắc ký dưới dạng khí.

4.3. Cột sắc ký

Dạng cổ điển nhất của cột sắc kýkhí là cột nhồi với một cột thủy tinh hay thép không rỉ hở hai đầu có đường kính trong 2 - 4 mm, dài 1 - 4 m, bên trong nhồi đầy pha tĩnh. Tuy nhiên, ngày nay phần lớn (trên 90%) các cột sắc ký khí là mao quản. Cột mao quản thường được làm bằng silica nung chảy có đường kính  trong từ 0,1 - 0,53 mm với chiều dài 10 - 100 m hay hơn. Các cột thông thường có đường kính trong 0,2 mm, 0,25 mm hay 0,32 mm vời chiều dài 25 - 60 m. Thành trong của cột mao quả có thể tráng lên một lớp pha tĩnh lỏng với bề dày 0,2 - 5 mm (wall coated open tubular, WCOT) hay được phủ một lớp hạt có một lớp pha tĩnh lỏng bao quanh (support coated open tubular, SCOT) hoặc một lớp pha tĩnh xốp của chát hấp phụ hay rây phân tử (porous layer open tubular, PLOT)... loại cột mao quản thông dụng nhất hiện nay là WCOT. So với cột nhồi, cột mao quản có hiệu năng tách cao hơn rất nhiều. Một cột mao quản 60 m có thể có 180.000 - 300.000 đĩa lý thuyết so với 4000 đĩa lý thuyết của cột nhồi )2m). Loại cột nhồi có đường kính nhỏ hơn (microbore; 0,75 mm) được xem như là dạng trung gian giữa cột nhồi và mao quản.

Pha tĩnh trong sắc ký khí cũng khá đa dạng. Các pha tĩnh rắn với cơ chế hấp phụ (silacagel, nhôm oxyd), rây phân tử hay gặp trong cột nhồi. Tuy nhiên, pha tĩnh phổ biến nhất là pha tĩnh lỏng theo cơ chế phân bố. Pha tĩnh lỏng có thể được phủ lên một giá mang trong cột nhồi hay tráng lên thành trong của cột mao quản.

Lượng pha tĩnh trong cột càng lớn, khả năng tách và lượng mẫu có thể phân tích của cột càng cao. Trong cột nhồi, lượng pha tĩnh có thể chiếm tới 25% khối lượng của vật liệu nhồi cột.

Các chất lỏng sử dụng làm pha tĩnh cũng khá đa dạng về nguồn gốc và độ phân cực. Hai loại pha tĩnh thông dụng nhất là dẫn chất của polysiloxan và polyethylen glycon. Các dẫn chất polysiloxan (methyl polysiloxan, các hỗn hợp của methyl polysiloxan, phenyl polysiloxan và cyano polysiloxan) có độ phân cực từ kém tới trung bình. Các polyethylen glycon là pha tĩnh phân cực. Tên gọi của pha tĩnh khác nhau theo hãng sản xuất như OV, SE hay DB... cho các loại dẫn chất polysiloxan, Carbowax, CP-wax hay DB-wax... cho polyethylen glycon với các chữ số đứng sau để chỉ loại polysiloxan hay polyethylen glycon sử dụng. Các pha tĩnh khác như dầu apiezon, squalen, các alcol có độ sôi cao và những ester của chúng... cũng được sử dụng. Mỗi pha tĩnh đề có những nhiệt độ giới hạn của chúng, vượt quá nhiệt độ này sẽ làm pha tĩnh mau hư hỏng. Các dẫn chất polysiloxan, nhiều độ thường không được quá 340 - 360⁰C, còn với polyethylen glycon, nhiệt độ thường không được quá 250⁰C.

4.4. Buồng cột

Nhiệt độ là một yếu tố có ý nghĩa quan trọng trong việc tách các chất của quá trình sắc ký khí. Trong suốt quá tình phân tích, nhiệt độ của cột phải đồng đều trên tòan bộ cột. Nhiệt độ cột phải ổn định, chính xác và thay đổi được theo yêu cầu phân tích. Phân tích sắc ký khí có thể được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt (isothermal) hay nhiệt độ tăng dần theo chương trình nhiệt (gradient). Để đạt được điều này, toàn bộ cột sắc ký được đặt trong một khoang kín được gọi là buồng cột. Buồng cột được cách nhiệt và có các thiết bị gia nhiệt, theo dõi nhiệt độ và phân phối nhiệt, giữ cho nhiệt độ cột phân tích đồng đều, ổn định và tuân theo yêu cầu phân tích.

4.5. Detector

Có nhiều loại detector khác nhau sử dụng trong sắc ký khí. Detector phổ biến nhất hiện nay là detector ion hóa ngọn lửa (flame ionization detector, FID), đây là loại detector phổ thông, phát hiện được hầu hết các chất phân tích, nhạy và có khoảng tuyến tính động học khá rộng, thích hợp cho việc định lượng. Loại này có thiết kế đơn giản và cũng tương đối rẻ tiền. Detector MS với nhiều kỹ thuật đo khác nhau ngày càng trở nên phổ biến hơn vì tính hiệu dụng của nó. Nó phát hiện được rất nhiều chất những cũng là một detector rất chọn lọc khi sử dụng kỹ thuật phát hiện chọn lọc ion. Phổ khối có độ nhạy cao và khoảng tuyến tính động học lớn thích hợp cho việc định lượng. Detector MS còn cung cấp những thông tin hữu ích về khối lượng phân tử và các phân mảnh để xác định cấu trúc các chất.

Ngoài ra, còn có các detector phổ thông hay đặc hiệu khác thích hợp cho từng nhóm hợp chất. Tuy nhiên, các detector này ít phổ biến.

Để xác định một chất nào đó, ngòai thời gian lưu (t_r), người ta còn sử dụng chỉ số lưu Kovats (hay còn được gọi là chỉ số Kovats hay chỉ số lưu). So với t_r, chỉ số lưu Kovats ổn định hơn do bù trừ được những sai lệch do thiết bị và điều kiện phân tích. Để xác định chỉ số lưu Kovats của một chất, người ta tiến hành sắc ký chất đó với 2 chất chuẩn là hydrocarbon được chọn sao cho một chất được rửa giải trước và chất còn lại được rửa giải ra sau là chất xác định. Chỉ số Kovats được tính dựa trên mối liên hệ (logarit) của thể tích lưu (thời gian lưu) hiệu chỉnh của chất đó với 2 chất chuẩn.

Sắc ký khí là phương pháp có hiệu năng tách rất cao, cao hơn nhiều so với HPLC. nó có thể phân tích những hỗn hợp rất phức tạp mà HPLC không phân tích nổi.

Tuy nhiên, nhược điểm của sắc ký khí là phương pháp này chỉ có thể sử dụng cho phân tích các chất bay hơi. Các chất không bay hơi ở nhiệt độ phân tích (thường không quá 300⁰C) muốn phân tích được cần phải biến đổi thành dẫn chất bay hơi bằng cách ethyl hóa (methyl hóa, tolyl hóa, silyl hóa). Điều này làm hạn chế khả năng ứng dụng của sắc ký khí. Mặc dù vẫn có thể sử dụng trong sắc ký điều chế nhưng trên thực tế, sắc ký khí gần như chỉ dùng trong phân tích định tính và định lượng.

Trong phân tích dược liệu, sắc ký khí rất thích hợp cho phân tích tinh dầu và các chất bay hơi. Đặc biệt, khi kết hợp với phổ khối kế và thư viện phổ, hệ thống GC-MS có thể phân tích và cho biết thành phần của tinh dầu và các chất bay hơi rất nhanh và hiệu quả. Các kết quả phân tích khối phổ trên hệ thống sẽ được so sánh với một cơ sở dự liệu về khối phổ ESI-MS (được gọi là thư viện phổ) để xác định các chất phân tích.

Có nhiều thư viện phổ khác nhau nhưng lớn và thường được sử dụng nhất là thư viện phồ NIST. Hiện nay là phiên bản NIST-08 của Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia, Mỹ (National Institute of Standards & Technology). Thư viện có 220.460 phổ khối EI-MS của 192.108 hợp chất thuộc các nhóm: (a) Thuốc, chất chuyển hóa và chất độc, (b) Thuốc trừ sâu và trừ nấm, (c) các chất hữu cơ trong đất, nước và không khí, (d) aminoacid, di- và tri-peptid, (e) các tạp chất thông thường và (f) các dẫn chất phân tích của các nhóm trên. Thư viện còn có 14.802 phồ MS/MS của 5.308 ion (3.898 cation và 1.410 anion) và 224.308 chỉ số lưu Kovats của 21.847 chất trên cả cột không phân cực và phân cực.

Một ứng dụng khác hiện nay cũng được quan tâm là phân tích dư lượng các chất bảo vệ thực vật còn lại trên dược liệu, dioxin và các chất độc hại trong thực phẩn, lượng dung môi tồn dư của thuốc, các chất ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe con người (các hợp chất thơm đa vòng...). Các chất này thường tồn tại vời một lượng rất nhỏ trong hỗn hợp phức tạp, rất khó để phát hiện, định danh cũng như định lượng chúng bằng các phương pháp sắc ký khác.

5. Điện di mao quản

Điện di là một phương pháp phân tích dựa trên sự khác nhau về độ linh động điện đi (linh độ điện di, electrophoretic mobility, m) của hai hay nhiều chất hay tiểu phân tĩnh điện trong điện trường.

Khi một dung dịch các chất được đặt trong một điện trường, các chất phân ly thành ion hay có khả năng tạo các tiểu phân tĩnh điện sẽ dịch chuyển về phía điện cực trái dấu với nó. Tốc độ dịch chuyển của các ion trong hệ thống phụ thuộc vào độ lớn của điện trường, bản chất của chất phân tích và một số yếu tố khác của môi trường phân tích. Trong cùng một hệ, tốc độ dịch chuyển của các chất phụ thuộc vào độ linh động điện di của chất đó. Các chất có điện tích và/hoặc hình dạng và kích thước phân tử khác nhau sẽ dịch chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường và tách khỏi nhau trong hệ điện di.

Có 2 phương thức điện di chính là điện di trên mặt phẳng và điện di mao quản. Điện di trên mặt phẳng là phương pháp điện di được áp dụng sớm nhất. Bản điện di là một mặt phẳng được trắng bởi 1 lớp gel (tinh bột, agar, agarose hay polacrilamid), một lớp giấy lọc hay 1 bản mỏng trải silicagel, cellulose, cellulose acetat, nitrocellulose. Tất cả được tẩm dung dịch đệm. Lớp gel, giấy hay silicagel... chỉ làm nhiệm vụ giá mang để giữ dung dịch đệm là môi trường để cho các ion dịch chuyển. Mẫu thử được đưa lên lớp gel. Hai cực của một điện trường mạnh tạo bởi dòng điện một chiều được áp trên 2 đầu đối diện của lớp gel làm các chất dịch chuyển về cực trái dấu tạo nên các băng trên bản điện di. Các băng này có thể được phát hiện bằng màu sắc trong ánh sáng thường, trong ánh sáng tử ngoại hay dùng các thuốc thử tạo màu hay tạo thành các chất phát huỳnh quang. Do hiệu ứng sinh nhiệt Joule, điện thế áp dụng trong điện di trên mặt phẳng thường chỉ trong khoảng 15 - 40 V/cm để tránh sự tăng nhiệt quá mức làm khô dung dịch đệm trên bản điện di. Có nhiều kỹ thuật khác nhau được sử dụng trong điện di trên mặt phẳng.

Sơ đồ thiết bị điện di mao quản

Trong điện di mao quản (Electrophoresis, CE), các chất được phân tách trong một mao quản silica nung chảy được chứa đầy dung dịch điện giải. Đường kính trong của mao quản thường từ 20 - 100 mm, chiều dài mao quản thay đổi thường là 20 - 30 cm kể từ đầu vào đến detector. Chiều dài tối đa của mao quản là 100 cm. Hai đầu ống mao quản được nhúng vào 2 cốc đựng dung dịch điện giải. Ở gần một đầu của mao quản được gắn với detector. Hai đầu mao quản được nối với hai cực của nguồn điện một chiều (có thể thay đổi điện thế được) có điện thế thường vào khoảng 5 - 30 KV (có thể tới 800 V/cm). Điện thế càng lớn các chất dịch chuyển càng nhanh nhưng có thể không kịp tách ra khỏi nhau. Thay đổi điện thế có thể đạt được việc phân tách tốt trong thời gian ngắn nhất.

Trong CE, tất cả các ion đều dịch chuyển về phía cực âm (cathod) mặc dù lực điện di làm các ion dương và âm dịch chuyển ngược chiều nhau. Hiện tượng này là do dòng điện thẩm (electroosmotic flow, EOF) sinh ra trong dung dịch đệm trong lòng mao quản silica nung chảy. Dòng điện thẩm này dịch chuyển về cathod với tốc độ có thể tới 2 mm/s và phụ thuộc vào pH, độ nhớt của môi trường... và thường lớn hơn tốc độ dịch chuyển của các ion theo linh độ điện di. Như vậy, các ion dương sẽ dịch chuyển nhanh hơn tốc độ điện di vốn có của nó, các chất trung tính sẽ dịch chuyển vào tốc độ của dòng điện thẩm còn các ion âm sẽ dịch chuyển chậm hơn và ngược chiều với chiều điện di. Các chất khác nhau sẽ tách ra khỏi nhau và dịch chuyển qua detector để được phát hiện và ghi thành điện di đồ.

Các detector sử dụng trong điện di cũng rất phong phú và có độ nhạy cao. Detector thông dụng nhất vẫn là detector tử ngoại. Detector có thể gắn trực tiếp trên mao quản, dùng mao quản như tế bào đo hay dùng các tế bào đo riêng biệt. Nhược điểm của phương pháp đo trực tiếp trên mao quản là độ nhạy thấp do quãng đường ngắn. Các detector huỳnh quang, laser, điện hóa hay dẫn điện... cũng được sử dụng. Việc kết nối máy điện di mao quản với khối phổ kế có những khó khăn nhất định về mặt giao diện. Tuy nhiên các thiết bị CE-MS hiện đã có mặt trên thị trường, tăng khả năng ứng dụng của điện di mao quản. Kỹ thuật ion hóa trong CE-MS chủ yếu là kỹ thuật phun điện (electro spray ionization, ESI).

Trong điện di mao quản, các kỹ thuật điện di sau được sử dụng:

-      Điện di vùng (zone electrophoresis) là kỹ thuật đợn giản và được áp dụng rộng rãi nhất hiện nay trong cả điện di trên mặt phẳng vào mao quản. Trên mao quản, kỹ thuật này được gọi là điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis, CZE). Việc thêm vào dung dịch đệm một số chất sẽ cho các kỹ thuật điện di mới như MECK, CIEF, CSE.

-  Sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography, MEKC) là một phương pháp điện di trong đó mẫu thử được tách ra bởi sự phân bố khác nhau của chúng trong các micell (được xem như là một pha tĩnh giả) và dung dịch đệm (pha động). Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dung dịch đệm ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn. Trong phần lớn trường hợp, MEKC được tiên hành trong môi trường kiềm. Natri dodecyl sulfat (SDS) là chất hoạt động bề mặt thường sử dụng nhất.

-  Sắc ký điện động vi nhũ tương (microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC) có thể xem như một kỹ thuật mở rộng của MEKC. MEEKC sử dụng các vi nhũ tương (thường là dầu/nước) làm pha tĩnh giả. MEEKC linh động và hiệu quả hơn MEKC, có thể dùng cho cả chất phân ly và trung tính hay trong phân tích quang hoạt. MEEKC được dùng nhiều trong phân tích dược phẩm

-  Sắc ký điện di mao quản (capillary electrochromatography, CEC): là một kỹ thuật mới được phát triển gần đây sử dụng dòng điện thẩm để đưa dung môi rửa giải đi qua pha tĩnh của cột nhồi HPLC có dung môi. CEC sử dụng thiết bị điện di thông thường nhưng có thêm ưu điểm là việc ghép nối với detector khối phổ dễ dàng hơn so với điện di mao quản thông thường. Các chất trung tính cũng có thể phân tách với hiệu quả rất cao trong kỹ thuật này.

-  Điện di rây mao quản (capillary sieving electrophoresis, CSE): Trong điện di rây mao quản, dung dịch đệm được thêm vào những chất có tác dụng cản trở vật lý sự di chuyển của các phân tử như polyethylen oxyd hay dextran. Các phân tử lớn như protein sẽ di chuyển chậm hơn do ma sát hay cản trở bởi các chất này. Mức độ bị cản trở phụ thuộc vào khối lượng hay bán kính thủy động của phân tử. Nếu thêm vào môi trường điện di các chất có cấu trúc mạng 3 chiều tương tự như sắc ký lọc gel ta có Điện di gel mao quản (capillary gel electrophoresis, CGE). Tuy nhiên, trong điện di mao quản, CSE cho kết quả lặp lại và tin cậy hơn, dễ thay thế sau khi điện di nên được sử dụng rộng rãi hơn trong phân tích protein.

-  Ngoài các kỹ thuật trên, một số kỹ thuật điện di mao quản khác cũng được sử dụng. Ví dụ như: Điện di hội tụ đẳng điện (isoelectric focusing, IEF), Điện di đẳng tốc (isotachophoresis, ITP)...

Điện di mao quản có hiệu lực phân tách rất cao. Một trong những yếu tố quan trọng là các chất được di chuyển đồng đều trong mao quản tạo nên các băng dịch chuyển chứ không phải các vùng dịch chuyển dạng parabol như trong sắc ký lỏng cao áp. Điều này hạn chế sự dãn rộng các băng phân tách, tạo nên các đỉnh hẹp trên điện di đồ làm choh dung lượng peak của điện di cao hơn, đồng nghĩa với độ phân giải cao hơn. Khi chọn được các điều kiện điện di thích hợp, độ phân giải của phương pháp có thể đạt được rất cao. Số đĩa lý thuyết trong một hệ điện di mao quản có thể đạt tới hàng trăm ngàn (thường là 100.000 - 250.000 đĩa lý thuyết), thậm chí hàng triệu (có thể tới 30.000.000 đĩa lý thuyết trong CGE các oligonucleotid). Do các đỉnh của các chất tách ra hẹp hơn nên chúng có cường độ lớn hơn, góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp. Phương pháp điện di nguyên thủy (điện di vùng) vốn chỉ áp dụng cho các chất ion hóa. Vì thế, trong một hỗn hợp phức tạp gồm cả các chất điện ly và trung tính, chỉ có các chất điện ly di chuyển làm cho điện di đồ trở nên đơn giản hơn, thích hợp hơn với việc định lương. Thiết bị điện di mao quản tương đối đơn giản, việc sử dụng cũng ít tốn kém về vật tư tiêu hao hơn các phương pháp sắc ký khác.

Điện di mao quản cũng có những nhược điểm so với các phương pháp sắc ký khác. Điện di mao quản chủ yếu được dùng cho các chất có thể điện ly. Mặc dù các kỹ thuật điện di có thể phân tách được các phân tử không ion hóa nhưng việc phát triển phương pháp và áp dụng chúng trong phân tích các hợp chất tự nhiên còn tương đối hạn chế. So với sắc ký lỏng, việc chọn các điều kiện phân tích (dung dịch đệm, điện thế) cũng hạn chế và ít linh động hơn so với lựa chọn dung môi và pha tĩnh sắc ký.

Kỹ thuật điện di đã được áp dụng vào phân tích các hợp chất tự nhiên (alkaloid, acid amin...) từ khá sớm (giữa những năm 1950) với điện di trên mặt phẳng. Tuy nhiên, do không thuận tiện bằng sắc ký lớp mỏng và HPLC phát triển sau đó (1970) nên ít được sử dụng. Kỹ thuật này hiện nay chủ yếu được sử dụng trong phân tích các đại phân tử (protein, polysaccarid, vật liệu di truyền...) trong sinh hóa, lâm sàng và các lĩnh vực liên quan.

Từ khi các thiết bị điện di mao quản được thương mại hóa vào năm 1987, với các ưu diểm trong phân tích các phân tử nhỏ, điện di mao quản đã thu hút sự quan tâm của các nhà phân tích hóa hợp các chất tự nhiên. Trong các hợp chất tự nhiên, các hợp chất phenol, alcaloid, các acid, acid amin rất thích hợp với phân tích điện di mao quản về cả định tính và định lượng. Các kỹ thuật điện di thường sử dụng trong phân tích dược liệu là CZE, MEKC và CEC.